EGFRvⅢ/CAR-T对EGFRvⅢ + U87胶质瘤细胞和裸鼠移植瘤的特异性 杀伤作用

目的： 制备靶向EGFRvⅢ的第三代CAR-T(EGFRvⅢ/3CAR-T),检测其在体外和体内对EGFRvⅢ + U87胶质瘤细胞的 特异性杀伤效应。 方法： 用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染HEK293T细胞包装EGFRvⅢ/3CAR慢病毒（LV-EGFRvⅢ/3CAR）,感 染健康人CD3 + T细胞,Western blotting和流式细胞术检测T细胞中EGFRvⅢ/3CAR的表达水平, 51 Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR- T对EGFRvⅢ + U87细胞的体外杀伤效应,ELISA法检测EGFRvⅢ/3CAR + T的IFN-γ分泌水平。构建裸鼠异种胶质瘤移植模型, 检测EGFRvⅢ/3CAR-T对移植瘤的体内杀伤活性。 结果： EGFRvⅢ/3CAR慢病毒包装成功,滴度值为5×10 6 TU/ml。Western blotting在相对分子质量58 000处检测到EGFRvⅢ/3CAR表达,未转导组无相同分子量蛋白表达。流式细胞术检测结果显示EG- FRvⅢ/3CAR转导效率平均为52.3%, 51 Cr释放法检测EGFRvⅢ/3CAR-T特异性杀伤作用与E∶T值（E∶T为4∶1、为8∶1、16∶1、32∶ 1）呈正比关系。ELISA法检测到细胞因子IFN-γ分泌量为(1 836±148.2) pg/ml,与NT T和GFP + T细胞相比差异有统计学意义 （ P ＜0.01）。EGFRvⅢ/3CAR + T细胞的特异性杀伤活性及IFN-γ分泌均依赖于EGFRvⅢ在U87细胞中的表达水平。体内肿瘤生 长检测结果显示,注射后3周EGFRvⅢ/3CAR + T组肿瘤体积较GFP + T细胞和PBS组差异有统计学意义（ P< 0.01）。 结论： EGFRv Ⅲ/3CAR-T在体外和体内均能发挥靶向杀伤EGFRvⅢ + 脑胶质瘤细胞的作用,为后续临床试验提供依据。     

双特异性CAR-T细胞对EGFRvⅢ+/CD133+胶质瘤干细胞的靶向杀伤

目的：制备双特异性CAR-T(bs CAR-T)细胞,观察其对表达表皮生长因子Ⅲ型突变阳性(EGFRvⅢ⁺,简称vⅢ⁺)和CD133+胶质瘤干细胞的靶向杀伤作用。方法：基于前期研制的vⅢ/CD133双特异性微抗体和二代CAR构建的双特异性CAR(bs CAR),制备慢病毒载体转染人外周血T细胞,FCM和WB法检测bs CAR转染效率和表达水平。bs CAR-T细胞和vⅢ⁺/CD133⁺U87胶质瘤干细胞共培养,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验、IFN-γ分泌实验检测其特异性杀伤作用和对IFN-γ分泌的促进作用。制备裸鼠vⅢ+/CD133+U87干细胞移植瘤模型检测bs CAR-T细胞对移植瘤生长的抑制作用。结果：vⅢsc Fv和CD133sc Fv通过重叠PCR无缝连接入二代CAR表达框(S-vⅢscFv/CD133scFv-Hinge-TM-CD137-CD3ζ)中,然后克隆入p CDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP载体的Eco RⅠ和Bam HⅠ位点(pbs CAR)。3种质粒(p VSV...     

CD3ζ链引入YRHQ基序可增强靶向HER2的CAR-T细胞的抗肿瘤活性

目的： 探讨在靶向HER2的CAR的CD3ζ链胞内区引入YRHQ基序对CAR-T细胞的特异性杀伤活性及免疫记忆形成的影响。 方法： 通过DNA合成获得包含靶向HER2的编码抗原受体H28ζ或H28ζ(YRHQ)的DNA片段,通过慢病毒载体将不同CAR的DNA片段分别转导健康人外周血T细胞,制备靶向HER2的H28ζ-CAR-T及H28ζ(YRHQ)-CAR-T细胞。扩增过程中对不同CAR-T细胞进行计数,FCM检测CAR的表达率。将CAR-T细胞分别与HER2阳性的SKOV3、MDA-MB-453或HER2阴性的MCF-7细胞共培养,LDH释放法检测其杀伤活性,ELISA法检测IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的水平,WB法检测STAT3磷酸化水平及免疫检查点分子TIM-3和PD-1的表达,通过FCM检测CCR7、CD45RO的表达,分析CAR-T细胞的表型。 结果： H28ζ-CAR-T和H28ζ(YRHQ)-CAR-T细胞扩增能力较好,体外培养7 d时扩增4~5倍。H28ζ-CAR和H28ζ(YRHQ)-CAR表达率分别为（33.3±2.85）%和（28.30±3.2）%。H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的杀伤活性较H28ζ-CAR-T细胞更高（P<0.05）。经HER2抗原刺激后,与T细胞或H28z-CAR-T细胞比较,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的STAT3磷酸化水平较H28ξ-CAR-T细胞明显升高（P<0.01）;而两者间PD-1和TIM-3的表达无明显差异。未经抗原刺激的CAR-T细胞CCR7和CD45RO表达与正常T细胞比较差异无统计学意义（均P>0.05）,与SKOV3细胞共培养后,与T细胞或H28z-CAR-T细胞比较,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞中 T EM 细胞比例明显增加、T CM 细胞比例明显减少（均P<0.05）。 结论： 在CD3胞内区引入YRHQ基序可在一定程度上提高CAR-T细胞的杀伤潜力。     

靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞的构建与功能鉴定

目的:构建靶向GPC3阳性肝癌细胞的嵌合抗原受体修饰T细胞[chimeric antigen receptor-modified T cell,CAR-T cell],并评估其对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤效能.方法:选择偏爱密码子技术改造基因序列,以增强CAR分子表达效率,设计靶向GPC3抗原的CAR分子基因并构建携带GPC3-CAR基因的慢病毒表达载体pCDH-GPC3-CAR,感染T细胞;采用Western blotting、流式细胞术、实时细胞监测和ELISA技术分别检测GPC3-CAR分子在CAR-T细胞的表达、慢病毒感染T细胞效率、GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤活性和特异性.结果:双酶切pCDH-GPC3-CAR重组慢病毒质粒可见分子质量和GPC3-CAR分子一致的基因片段,成功构建pCDH-GPC3-CAR慢病毒质粒.约54.38％的GPC3-T细胞表达GPC3-CAR分子,称为GPC3-CAR-T细胞.GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性的肝癌细胞Huh-7比GPC3阴性的肝癌细胞SK-HEP-1具有更高效的杀伤能力[(78.96±4.76)％ vs (6.87±3.15)％,P＜0.01].与GPC3阳性Huh-7肝癌细胞共培养的肝癌GPC3-CAR-T细胞分泌IFN-γ水平比Mock组高效[(21 371.4±1 808.3) vs (152.8±12.5) pg/ml,P＜0.01],这可能是其高效杀伤肝癌细胞的机制之一.结论:靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞具有高效分泌IFN-γ细胞因子并特异高效杀伤GPC3阳性肝癌细胞的能力,为进一步推进GPC3-CAR-T临床前和临床研究奠定基础.     

靶向FRα嵌合抗原受体T淋巴细胞杀伤结直肠癌细胞的研究

目的 探究叶酸受体α抗原(FRα)在结直肠癌中的表达情况,通过构建靶向FRα抗原的嵌合抗原受体(CAR)T淋巴细胞(FRα-CAR T),评估使用FRα-CAR T治疗结直肠癌的可行性。方法 应用生物信息学数据库(TIMER2.0)分析FRα抗原在结直肠癌组织中的表达情况及其与免疫细胞浸润的关系。使用慢病毒载体将编码靶向FRα抗原的二代CAR结构的基因转导入CD8⁺ T淋巴细胞,制备FRα-CAR T,流式细胞术分析转染效率。体外培养CACO-2和HCT-116细胞,采用流式细胞术分析FRα在肿瘤细胞表面的表达情况,将FRα-CAR T和CD19-CAR T及空载体转导的T细胞(mock T)作为效应细胞,CACO-2和HCT-116做为靶细胞,细胞计数试剂盒(CCK8)检测不同效靶比(1∶1、5∶1、10∶1和20∶1)对靶细胞的杀伤率;采用流式细胞术和ELISA法分别检测CAR T细胞杀伤CACO-2和HCT-116后细胞中干扰素γ(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)的分泌情况。结果 生物信息学分析显示FRα抗原在结直肠癌组织中表达水平高于正常组织(P=0....     

靶向人CD70的嵌合抗原受体巨噬细胞制备及其对肾癌的杀伤作用的研究

目的:本研究旨在探讨稳定感染靶向人CD70蛋白的嵌合抗原受体巨噬细胞(chimeric antigen receptor macophages, CAR-M)对人肾癌细胞系(786-O、OS-RC-2和ACHN)的体外杀伤作用,开发靶向人CD70的肾癌细胞的新型细胞疗法。方法:将含人CD70抗体scFv片段的CAR序列插入含有GFP序列的慢病毒质粒中,制备CD70-scFV-CAR-GFP的慢病毒。通过慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7制备CD70-CAR-M,通过流式细胞仪分选出含有绿色荧光标记的CD70-CAR-M细胞并在体外筛选稳定表达细胞株。将CD70-CAR-M细胞与不同类型的肾癌类器官按照1∶1的比例分别共培养后,利用流式细胞术检测CD70-CAR-M对肾癌细胞的杀伤作用。qRT-PCR检测CD70-CAR-M在和肾癌细胞系共培养后TNF-α和TGF-β的表达水平改变情况。结果:通过测序确认了CD70-scFV序列,并成功制备了相应的慢病毒。利用该慢病毒感染巨噬细胞RAW264.7,通过qRT-PCR技术证明CD70-CAR分子稳定表达在RAW264.7。通过和不同类型...     

针对前列腺癌的PSMA-CAR慢病毒表达载体的构建及病毒包装

目的:构建针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的CAR慢病毒表达载体，并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列，将设计的CAR 片段连入 pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro 载体中，经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三质粒包装系统将PSMA-CAR载体进行包装，通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测GFP鉴定包装结果及包装时的转染效率。通过超速离心方法浓缩病毒颗粒。结果:成功构建了PSMA-CAR 慢病毒表达载体，成功包装了PSMA-CAR 慢病毒颗粒且包装时的转染效率为70.43％，经测定获得的PSMA-CAR慢病毒滴度为5×105TU/mL。结论:PSMA-CAR 慢病毒表达载体的成功构建及病毒颗粒的包装为应用 CAR 技术治疗前列腺癌奠定了基础。     

靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体T细胞的构建及其对肿瘤细胞的杀伤

[摘要] 目的：探索通过嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）-T 细胞靶向B 细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）以治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）的方法。方法：构建基于鼠源BCMA scFv 的CAR-BCMA分子,包装为慢病毒载体并感染健康人T 细胞构建CAR-BCMA-T 细胞;构建BCMA阳性细胞系A549-BCMA、A549-BCMAOFP和K562-BCMA作为靶细胞。将CAR-BCMA-T细胞与构建的靶细胞和人骨髓瘤细胞U266 共孵育,CCK-8 法和流式细胞术检测其对BCMA阳性肿瘤细胞的杀伤能力。构建MM患者来源CAR-BCMA-T细胞并检测其杀伤靶细胞A549-BCMA的能力,并采用ELISA和流式细胞术检测CAR-BCMA-T细胞IFN-γ 的释放水平。结果：健康人来源的CAR-BCMA-T经过11 d 培养扩增300 倍,阳性率达到43%;成功构建BCMA阳性靶细胞。在5:1 效靶比下,CAR-BCMA-T对A549-BCMA、K562-BCMA和U266 细胞的杀伤率分别在80%、60%和80%左右,显著高于对BCMA阴性细胞的杀伤率,且杀伤力与靶细胞的BCMA表达强度相关。在效靶比20:1 时,MM患者来源CAR-BCMA-T细胞对靶细胞A549-BCMA的杀伤率达到95%以上,并且大量分泌IFN-γ。结论：本研究成功构建了健康人及MM患者来源的靶向BCMA的CAR-T细胞,其能够有效特异杀伤BCMA阳性的肿瘤细胞。     

siRNA沉默POLE2基因表达对非小细胞肺癌细胞增殖的影响

目的:构建DNA聚合酶εB亚基(POLE2)基因重组慢病毒载体,并检测其在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能。方法:RT-PCR技术检测POLE2基因在A549、NCI-H1975、NCI-H1299细胞中的表达。设计并合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火、酶切后产生GV115-shPOLE2慢病毒载体。该载体含有绿色荧光蛋白（GFR）,经聚合酶链式反应(PCR)筛选出阳性克隆并测序鉴定。将GV115-shPOLE2、Helper1.0、Helper2.0质粒共感染包装293T细胞,包装成假病毒颗粒并感染非小细胞肺癌A549细胞,经免疫印迹法（Western blot）检测筛选POLE2 siRNA有效靶点,从而进行细胞功能学实验。CCK-8法检测POLE2基因沉默对于细胞增殖能力的影响;克隆形成实验检测POLE2基因沉默对细胞克隆形成能力的影响;Casepase3/7检测POLE2基因沉默对细胞凋亡的影响。结果:RT-PCR结果证实POLE2基因在三株细胞中表达丰度均为高表达。PCR和测序结果显示,GV115-shPOLE2慢病毒载体构建正确,经Western blot法证明POLE2 siRNA对于POLE2的外源表达有明显沉默作用,是有效靶点。慢病毒转染A549细胞后细胞增殖明显减缓,细胞克隆数减少,凋亡细胞数增多,与转染阴性对照病毒的A549细胞组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:RNAi技术沉默POLE2基因表达后,POLE2 siRNA明显抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖。     

circSMARCA5通过CCL5富集Treg细胞促进非小细胞肺癌细胞的增殖

目的：检测circSMRCA5在非小细胞肺癌（NSCLC）组织和细胞中的表达,以及其在NSCLC发生发展中的潜在功能和机制。方法：用qPCR 法检测circSMARCA5在NSCLC 组织中的表达。使用慢病毒转染法将circSMARCA5过表达质粒和对照质粒pLC5分别转染人肺癌A549 和H1975 细胞。采用qPCR法检测稳定转染细胞中circSMARCA5的表达水平。通过CCK-8、克隆形成、细胞周期和异种移植瘤实验检测circSMARCA5 过表达对A549 和H1975 细胞生物学行为的影响。通过转录组测序、KEGG和GO富集分析,确定circSMARCA5可能的靶基因。分别构建circSMARCA5过表达A549、Lewis 细胞BABL/c 裸鼠和免疫正常的C57 小鼠皮下移植瘤模型,观察circSMARCA5对裸鼠皮下移植瘤生长的影响,流式细胞术检测对Lewis 细胞移植瘤组织中Treg 细胞水平的影响。结果：circSMARCA5在NSCLC 组织中呈高表达（P<0.01）。过表达circSMARCA5可以在体外促进NSCLC 细胞的增殖（P<0.05,P<0.01）。体内实验中,circSMARCA5 可以促进裸鼠皮下移植瘤的生长（P<0.01）。机制上,经KEGG 和GO 富集分析,确定C-C 趋化因子配体5（CCL5）为circSMARCA5 的下游靶基因。过表达circSMARCA5 组A549 和H1975 细胞中CCL5 的表达量增加（均P<0.05）。circSMARCA5 介导的CCL5 上调促进了免疫正常的C57 小鼠皮下移植瘤的生长。C57 小鼠皮下移植瘤制备成的单细胞悬液行流式细胞术检测显示,circSMARCA5过表达组的Treg 细胞比例高于对照组[（3.1±0.5）% vs （1.0±0.1）%,P<0.05]。结论：circSMARCA5在NSCLC组织中呈高表达,其可能通过CCL5将Treg 细胞招募到肿瘤中,导致肿瘤的免疫逃逸,促进NSCLC的进展。     

抗PD-1单克隆抗体联合CIK细胞对肺癌细胞株杀伤作用的研究

目的:研究程序性死亡受体1（program cell death-1,PD-1）单克隆抗体联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK cells）对肺癌细胞株的杀伤作用及相关机制,探究该治疗方法在肺癌治疗中的可行性。方法:患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）在体外采用多种细胞因子诱导为CIK,并用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析CIK细胞的表型。培养A520 及H1975肺癌细胞,利用FCM检测其表面HLA-ABC,HLA-A2,HLA-DR及PD-L1的表达情况。将CIK细胞和抗PD-1单抗Nivolumab单独或者联合作用于A520 及H1975肺癌细胞。用ELISPOT法测定不同组γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）的释放,用CCK8法检测CIK细胞对肺癌细胞株的杀伤率。结果:CIK细胞对于肺癌细胞株的杀伤随着效靶比（effect target ratio,E∶T）的增加而加强;对于PD-L1高表达的肺癌细胞,Nivolumab与CIK细胞联合使用对肺癌细胞株的杀伤优于单一的CIK细胞及Nivolumab。结论:对于PD-L1高表达的A520肺癌细胞,PD-1单抗Nivolumab能够提升CIK细胞的杀伤作用,而对于PD-L1表达水平低的H1975细胞,Nivolumab不能提升CIK细胞的杀伤作用。     

自杀基因作为一种“安全性开关”控制CAR-T细胞毒性的临床前研究

目的：探讨小分子化学诱导药AP1903能否在体内外终止过表达iCasp9自杀基因的CD19靶向嵌合抗原受体修饰T（CD19CAR-T）细胞毒性功能。方法：构建过表达iCasp9的CD19CAR-T（iCasp9-CD19CAR-T）细胞并和AP1903共孵育，采用流式细胞术检测细胞表型及凋亡的方法，分别在K562和T细胞上验证iCasp9/CID自杀基因系统，在体内（观察荷Raji细胞移植瘤NCG小鼠的生存率）和体外（流式细胞术检测细胞的杀伤功能）检测AP1903给药情况下iCasp9-CD19CAR-T细胞的杀伤功能。结果：和 CD19CAR-T 细胞相比，iCasp9-CD19CAR-T 细胞的增殖能力、表型及体内外杀伤功能均无显著差异（均 P>0.05）。AP1903给药2 h后双表达iCasp9和CD19CAR的K562和T细胞分别有（33.8±0.9）%和（27.95±0.35）%的细胞出现凋亡，AP1903给药 24 h 后双表达 iCasp9 和 CD19CAR 的 K562 和 T 细胞均已经全部死亡。检测 AP1903 给药和未给药两种条件下的 iCasp9-CD19CAR-T细胞体外杀伤效率，前者明显低于后者（P<0.01）；iCasp9-CD19CAR-T细胞治疗荷Raji细胞移植瘤NCG小鼠，其60 d 生存率同样是AP1903给药的明显低于未给药的（P<0.01）。结论：小分子化学诱导药物AP1903能在体内外有效终止iCasp9-CD19CAR-T细胞毒性功能。     

PSMA-CAR-CIK转基因细胞体外杀伤三种前列腺癌细胞株效率的研究北大核心

目的:本研究通过检测前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)-肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK)转基因细胞杀伤三种前列腺癌细胞株的效率,鉴定其用于后期治疗前列腺癌的可行性。方法:通过已经构建的二代PSMA-CAR慢病毒表达载体转染CIK细胞,构建PSMA-CAR-CIK转基因细胞;通过CCK8法检测CIK细胞及PSMA-CAR-CIK转基因细胞杀伤三种前列腺癌细胞株PC3、LNCaP、DU145的效率及效靶比。结果:转基因PSMA-CAR-CIK细胞构建成功;3 h~3.5 h为检测效应细胞对靶细胞细胞毒活性时与CCK8试剂孵育的最佳时间;两种效应细胞均在效靶比为10∶1、15∶1、20∶1时,杀伤率逐步增高,无统计学意义(P>0.05),但与其它组相比差异显著(P<0.05)。结论:两种效应细胞对于前列腺癌细胞的杀伤,只要效靶比达到10∶1的比例,就能起到一个较好的杀瘤效果,并且随着效应细胞的增加,其抗肿瘤能力逐步加强;转基因PSMA-CAR-CIK细胞的构建为CAR技术治疗前列腺癌的临床应用奠定了基础。     

CD80-链亲和素融合蛋白锚定的鼻咽癌CNE2细胞增强T细胞的杀伤活性

目的：制备CD80-链亲和素（streptavidin,SA）融合蛋白,研究CD80-SA锚定的鼻咽癌CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。方法：pET21a-CD80-SA-6His质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导CD80-SA融合蛋白的表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后透析复性。流式细胞仪检测CD80-SA融合蛋白在CNE2细胞表面的锚定效率;LDH释放法检测CD80-SA锚定的CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。结果：成功制备和纯化了CD80-SA融合蛋白。CNE2细胞表面低表达CD80分子\[（2.2±0.18）％\]。CD80-SA融合蛋白可有效地锚定于生物素化的CEN2细胞表面,锚定效率可达73%。CD80-SA锚定的CNE2细胞可有效激活T细胞的杀伤作用,效靶比在1∶1、1∶20、1∶40时T细胞的杀伤率分别约为(37±3.12)%、(51±263)%和(58±2.47)%,均显著高于对照CNE2细胞激活的T细胞（均P<0.01)。结论：CD80-SA融合蛋白可有效锚定于生物素化的CNE2细胞表面,从而增强T细胞对CNE2细胞的杀伤活性。     

慢病毒载体介导的自杀基因系统YCD/5-FC对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞杀伤效应的研究

背景与目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)可将无毒性的抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)转化为细胞毒性产物氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),进而阻抑DNA、RNA和蛋白质合成,引起细胞死亡.本研究中构建含YCD基因的慢病毒载体质粒,体内外观察YCD/5-FC自杀基因系统的杀伤效应.方法:应用亚克隆技术将YCD和绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein,GFP)连接至慢病毒空载体pFUW,构建获得pGC-FU-YCD-GFP.将3质粒系统(含包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)脂质体法共转染包装细胞293T,获得的慢病毒转染人Jurkat细胞,流式细胞仪(FACS)和Western blot检测Jurkat/YCD-GFP表达水平;加入前体药物5-FC,观察对靶细胞的杀伤情况和旁观者效应.转基因细胞接种至裸鼠前肢皮下,观察体内肿瘤杀伤情况.结果:慢病毒载体3质粒系统感染293T细胞后,获得的慢病毒滴度为1.2×108TU/mL.该病毒可高效转染人Jurkat细胞,感染率达96.93%,Western blot显示转基因细胞可分泌YCD蛋白.100 μmol/L 5-FC作用96 h可杀伤(89.37±6.57)%的Jurkat/YCD-GFP细胞.混合培养提示存在明显的旁观者效应.转基因细胞可在小鼠体内致瘤,5-FC可明显抑制肿瘤生长.结论:成功构建慢病毒载体pGC-FU-YCD-GFP,YCD/5-FC自杀基凶系统在体内外均有显著的特异性杀伤效应.     

慢病毒介导YCD/5-FC自杀基因系统对白血病Jurkat细胞杀伤和旁观者效应

目的:探讨慢病毒介导的酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)自杀基因对人白血病Jurkat细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法:制备YCD-GFP慢病毒上清,转染Jurkat细胞(即Jurkat/YCD-GFP细胞),流式细胞术检测YCD-GFP基因的表达。体外观察前体药物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对Jurkat/YCD-GFP细胞的杀伤情况和旁观者效应;建立Jurkat/YCD-GFP荷瘤小鼠模型,体内观察5-FC对移植瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。以上实验均以Jukut/GFP细胞为对照。结果:成功制备YCD-GFP慢病毒和感染YCD-GFP慢病毒的Jurkat/YCD-GFP细胞,YCD-GFP慢病毒对Jurkat细胞的感染率达96.93%。232μmol/L的5-FC作用72h可使(95.61±2.07)%的Jurkat/YCD-GFP细胞死亡,且上清中5-FC含量下降80%左右。体外实验显示,Jurkat/YCD-GFP和Jurkat细胞效靶比1∶10混合培养[(68.69±4.97)%vs(97.87±1.11)%,P<0.05)]和Transwell1∶25分层培养[(1.46±0.27)×105vs(3.00±0.16)×105,P<0.01]均存在旁观者效应。体内实验显示,YCD/5-FC自杀基因系统对Jurkat/YCD-GFP荷瘤小鼠亦具有较强的杀伤作用和旁观者效应(P<0.05)。结论:慢病毒介导的YCD/5-FC自杀基因系统对人Jurkat白血病细胞具有显著的杀伤作用和旁观者效应。     

不同抗原表位CART-30细胞对经典型霍奇金淋巴瘤细胞株的杀伤作用及优化研究

背景与目的 CD30-CART细胞现已应用于复发/难治性CD30阳性的经典霍奇金淋巴瘤（classical hodgkin lymphoma,cHL）患者中并取得一定疗效,但其疗效仍待进一步提高,本研究选择不同抗原表位的两种单克隆抗体Ki-4和Ber-H2,优化性构建不同CAR基因片段载体,探讨两种CART细胞对CD30阳性的cHL细胞L428的杀伤作用及其作用机制。方法 构建携带不同抗原表位的CD30-CAR基因片段的慢病毒载体,通过流式细胞检测技术比较两种不同抗原表位CART-30细胞对cHL细胞的杀伤作用,采用蛋白质免疫印迹法（western blotting,WB）分析不同抗原表位的CART-30细胞对cHL细胞NF-κB通路的调控作用。结果 成功构建了不同抗原表位的CD30-CART细胞,平均阳性率为65.7%。Ki-4组效靶比为1∶1时,杀伤效率平均值为（35.15±4.13）%(n=6);效靶比为10∶1时,杀伤效率的平均值为（66.99±4.36）%(n=6)。Ber-H2组效靶比为1∶1时,杀伤效率的平均值为（31.95±3.11）%(n=6);效靶比为10∶1时,杀...     

shRNA抑制非小细胞肺癌H460SM细胞锚定非依赖生长和侵袭

目的:探讨慢病毒介导α6整合素(integrinα6,ITGA6)shRNA对人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)H460SM细胞生长和侵袭的影响。方法:实时定量PCR和Western blotting检测ITGA6在9种NSCLC细胞中的表达。慢病毒介导ITGA6 shRNA感染H460SM细胞后,实时定量PCR和Wesern blotting检测H460SM中ITGA6的表达,显微镜下观察H460SM细胞形态的变化,MTS法检测细胞增殖,软琼脂实验检测H460SM细胞锚定非依赖性生长,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,迁移和侵袭实验检测H460SM细胞体外迁移和侵袭能力。结果:ITGA6在7种人NSCLC细胞中均有表达,H460SM细胞中ITGA6表达水平明显高于亲本H460细胞[(8.75±0.09)vs(5.78±0.26),P<0.01]。慢病毒介导ITGA6shRNA稳定感染H460SM细胞后的H460SM-75、H460SM-76细胞中,ITGA6表达水平明显低于阴性对照组H460SM-NS细胞[(0.11±0.04)、(0.22±0.04)vs(1.00±0.01),P<0.01]。H460SM-75、H460SM-76细胞增殖活性与H460SM-NS细胞无差异(P>0.05),且凋亡率、细胞增殖指数、G0/G1期细胞的比例也无差异(P>0.05)。H460SM-75、H460SM-76细胞的克隆形成率明显低于H460SM-NS细胞[(18.87±1.47)%、(18.85±1.11)%vs(20.81±1.38)%,P<0.05],迁移率[(43.92±0.41)%、(24.10±0.33)%vs(100.00±0.50)%,P<0.01]和侵袭率[(7.04±2.96)%、(4.68±0.27)%vs(100.00±6.74)%,P<0.01]也明显低于H460SM-NS细胞。结论:抑制ITGA6的表达可以抑制NSCLC细胞锚定非依赖性生长、迁移和侵袭,但不影响NSCLC细胞增殖和凋亡。     

靶向CD33 的CAR修饰的NK92 细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用

[摘要] 目的：根据抗CD33-scFv 序列构建CD33-CAR 修饰的NK92 细胞,探讨其对CD33+ 急性髓系白血病（acute myeloidleukemia,AML）细胞的杀伤作用。方法：通过基因合成以及分子克隆技术获得抗CD33-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK92 细胞,用流式细胞术检测细胞转染效率并通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达抗CD33-CAR的细胞系CD33-CAR-NK92,利用钙黄绿素释放法检测该细胞的杀伤作用,ELISA法检测细胞因子IFN-γ 分泌的变化。结果：成功构建pCDH-CD33-CAR 重组慢病毒质粒,慢病毒转导后约18.7%的NK92 细胞表达CD33-CAR（命名为CD33-CARNK92细胞）,嘌呤霉素筛选后表达CD33-CAR的NK92 细胞比例约86.3%。CD33-CAR-NK92 细胞对CD33+AML细胞MOLM-13的杀伤作用明显高于未被基因修饰的NK92 细胞（P<0.01）,而两者对CD33-肿瘤细胞JURKAT 的杀伤作用没有明显差异（P>0.05）。效靶比为2∶1 共培养6 h 后,经CD33-CAR修饰的NK92 细胞相比未被基因修饰的NK92 细胞IFN-γ 的分泌水平明显升高[ （190.97±11.52）vs（88.41±2.75）pg/ml, P<0.01]。结论：CD33-CAR-NK92 细胞能特异性识别CD33 抗原并杀伤CD33+AML细胞,其杀伤作用显著高于未被基因修饰的NK92 细胞,为进一步开展靶向CD33 的CAR-NK92 细胞治疗AML的临床转化奠定了实验基础。