大鼠TIMP1 RNAi表达载体的构建及其对肝纤维化大鼠的修复

肝纤维化形成过程中涉及多种细胞及细胞因子之间的作用，肝脏星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节，而TGF-β1和TIMPs是HSC的早期“启动”的后期的“持久化”过程中关键因子，Kim KH等应用TGF-β1 siRNA修复小鼠肝纤维化模型，使工型胶原和α-平滑肌肌动蛋白表达下降。     

Toll样受体3基因缺陷促进四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化损伤

目的:探讨Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)基因缺陷对于四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型肝纤维化损伤程度的影响。方法:将20只野生型雄性小鼠和20只TLR3基因缺陷型(TLR3-/-)雄性小鼠分别分为野生型对照组、野生型造模组、TLR3-/-对照组和TLR3-/-造模组,每组各10只。对照组腹腔注射玉米油,造模组腹腔注射四氯化碳。造模8周后采集血液标本,应用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)水平;采用马松三色染色法对肝组织胶原沉积程度进行分析;采用α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)免疫组织化学染色法检测肝星状细胞的激活情况;应用试剂盒检测肝组织中的羟脯氨酸含量;采用实时荧光定量PCR法检测肝组织中纤维化标志物Ⅰ型胶原、炎性因子[包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和单核细胞趋化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)]以及促纤维化分子[包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)和血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)]的表达。结果:TLR3基因缺陷对于四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠血清中的ALT、AST、TBIL、ALB水平变化无影响。TLR3基因缺陷可加重四氯化碳诱导的肝组织胶原沉积和肝星状细胞激活;促进四氯化碳诱导的小鼠肝组织中羟脯氨酸的升高;使四氯化碳诱导的肝纤维化标志物Ⅰ型胶原增多,也使肝组织中炎性因子TNF-α、IL-6和MCP-1以及促纤维化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR表达升高。结论:TLR3基因缺陷可促进四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠肝组织中的胶原沉积和肝星状细胞激活,促进肝组织炎性因子释放,使肝促纤维化分子上调。以上提示,TLR3是肝纤维化病理过程中的一个保护性基因。     

慢性乙型肝炎患者肝组织中TGF-β1的表达分析

目的：观察转化生长因子β1(TGF-β1)在慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达，为肝纤维化的发生和发展机制提供进一步的实验依据。方法：实验采用免疫组化法检测慢性乙型肝炎患者肝穿刺组织中TGF-β1的表达及其变化规律。结果：TGF-β1阳性着色定位于细胞质，主要分布于肝脏非实质细胞中，包括内皮细胞、星状细胞、成肌纤维细胞。TGF-β1的表达随着炎症和纤维化评分增加而增强，且集中在炎症程度较重的门管区。结论：慢性乙型肝炎患者肝组织升高的TGF-β1主要由非实质细胞产生。TGF-β1的表达与肝组织炎症和纤维化程度呈正比。     

人脐带间充质干细胞来源的exosomes对脂多糖诱导的肝星状细胞活化的抑制研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)来源的外体(exosomes,hucMSC-Ex)对脂多糖(LPS)诱导的人肝星状细胞系LX2活化的抑制作用及其可能机制。方法体外培养LX2细胞,分别设PBS对照组、LPS组(100 ng/mL)及hucMSC-Ex组(LPS+150μg/mL hucMSC-Ex),48 h后收集细胞并提取相应的RNA及蛋白质。western blot检测LX2活化相关指标(α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白)和凋亡指标(Bcl2、Bax及caspase3蛋白)的表达情况;RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测α-SMA mRNA表达水平;MTT法分析hucMSC-Ex对LX2细胞活化后增殖的影响。结果 LPS可刺激LX2细胞活化,活化后的LX2细胞形态由不规则形状向成纤维细胞样改变,并高表达α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白,其灰度值分别上升约2.45、2.34、2.77倍(P均0.05);Bax及caspase3蛋白表达下降而Bcl2蛋白表达增强;LX2增殖能力增强;经hucMSC-Ex处理后,细胞形态由细长向不规则形态转变,α-SMA、ColΙα1及TGF-β1蛋白表达减弱,高表达Bax及caspase3蛋白而Bcl2蛋白表达下降,且细胞增殖减少(F=23.44,P0.05)。结论 hucMSC-Ex能够抑制LPS诱导的LX2细胞活化,降低其增殖能力并促进细胞凋亡。     

肝星状细胞增殖与p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的关系

背景：肝星状细胞的激活、增殖导致肝纤维化,p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路可参与调控细胞增殖。目的：探讨SB203580作用于乙醛刺激的大鼠肝星状细胞后p38丝裂原活化蛋白激酶活性变化和细胞增殖变化。方法：体外培养大鼠肝星状细胞株,在乙醛干预的基础上加入不同浓度的p38特异性抑制剂SB203580进行培养,并设置对照。以Westernblot检测磷酸化p38蛋白表达水平变化,MTT比色法检测细胞增殖。结果与结论：乙醛刺激后大鼠肝星状细胞内磷酸化p38水平增强,细胞增殖明显。使用5,10,20μmol/L SB203580能明显抑制乙醛刺激的肝星状细胞增殖（P〈0.05）,加大浓度至30μmol/L时,抑制作用更明显（P〈0.01）,抑制率为43.9%,而磷酸化p38水平也降低（P〈0.05）。结果证实,抑制p38丝裂原活化蛋白激酶活性可能影响肝星状细胞的增殖。     

慢性乙型肝炎患者肝组织中TGF-β_1的表达分析

目的:观察转化生长因子β1(TGF-β1)在慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达,为肝纤维化的发生和发展机制提供进一步的实验依据。方法:实验采用免疫组化法检测慢性乙型肝炎患者肝穿刺组织中TGF-β1的表达及其变化规律。结果:TGF-β1阳性着色定位于细胞质,主要分布于肝脏非实质细胞中,包括内皮细胞、星状细胞、成肌纤维细胞。TGF-β1的表达随着炎症和纤维化评分增加而增强,且集中在炎症程度较重的门管区。结论:慢性乙型肝炎患者肝组织升高的TGF-β1主要由非实质细胞产生。TGF-β1的表达与肝组织炎症和纤维化程度呈正比。现在上海第二医科大学附属第九人民医院消化内科工作.     

TGF-β/Smad信号转导通路在肝纤维化发病及诊治中的意义

肝纤维化是细胞外基质（ECM）合成和降解失衡，引起过多的ECM在肝脏沉积所致。现已证实肝纤维化发生的关键是肝星状细胞（HSC）的激活及其激活后ECM异常表达。转化生长因子β（TGF-β）是一类调节细胞生长和分化的多肽，具有活化HSC，促进肝脏胶原基因表达，促进ECM合成等作用，是最重要的促肝纤维化因子之一。     

肝纤维化中肝星状细胞和肌纤维母细胞的形态学观察

目的：观察肌纤维母细胞和肝星状细胞在人慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化过程中的作用。方法：对69例肝穿刺活检组织标本行HE、Masson三色及Sweet网织纤维的染色，按照2000年新的病毒性肝炎病理分级分期标准，进行炎症活动度和纤维化程度评定，应用免疫组织化学方法，观察平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、vimentin、结蛋白（desmin)在肝星状细胞、肌纤维母细胞的表达。结果：在慢性肝炎肝纤维化过程中α－SMA阳性细胞不仅仅是肝星状细胞的活化。结论：在人的慢性肝炎肝纤维化过程中，并不排除肝星状细胞所起的作用，但随着肝组织炎症损伤的修复，以肌纤维母细胞为代表的间叶细胞在纤维化过程中可能起主要作用。     

Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶的调节作用

目的:研究Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的调节作用。方法:60只Wistar雄性大鼠,随机分为正常对照组和模型组,采用白酒辅以玉米油、吡唑混合食料灌胃的方法制备大鼠酒精性肝纤维化模型,于造模12周后,采用免疫组化法检测大鼠肝组织α-SMA、β-catenin蛋白的表达,并进一步通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肝组织ILK mRNA的表达。结果:正常肝组织中有少量β-catenin、α-SMA蛋白和ILK mRNA的表达,模型组大鼠肝组织中β-catenin、α-SMA蛋白和ILKmRNA的表达明显升高(P<0.01)。β-catenin的表达量与α-SMA的表达呈正相关(r=0.913,P<0.01),ILK的表达量与β-catenin的表达亦呈正相关(r=0.880,P<0.01)。结论:酒精性肝纤维化发生发展过程中,Wnt信号通路在肝星状细胞活化的过程中可能发挥了重要的作用,ILK可能通过调节Wnt信号通路间接发挥了促进肝星状细胞活化的作用。     

血吸虫病肝纤维化小鼠中肝星状细胞迁移功能改变的实验研究

目的探讨影响日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织中肝星状细胞(HSCs)迁移运动功能变化的相关因素。方法 SPF级6⁸周龄Balb/c小鼠16只,随机分为模型组(8只)和对照组(8只),以血吸虫尾蚴腹部贴附法建立感染模型,正常组予以生理盐水代替。于感染后8周末处理小鼠,取部分肝组织石蜡包埋,进行病理学评估,免疫荧光染色检测HSCs(α-SMA,红光)运动蛋白Fascin(绿光)的表达;另取部分肝组织,采用Real-time PCR方法检测迁移诱导因子转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)以及单核细胞趋化因子1(MCP-1)的表达以及HSCs运动蛋白α-SMA、Fascin的表达。结果 8周末时,模型组小鼠肝组织中已形成明显肝纤维化。模型组小鼠肝组织中TGF-β1、PDGF以及MCP-1的基因表达水平分别是对照组的30倍、14倍及14倍,差异具有统计学意义(P=0.033、P=0.039以及P=0.037);同时,模型组中HSCs运动相关蛋白α-SMA和Fascin的基因表达水平分别是对照组的9倍和5倍,差异具有统计学意义(P=0.004、P=0.018);荧光共聚焦结果提示,模型组小鼠肝组织中α-SMA(红色)和Fascin(绿色)表达部位一致,集中在虫卵周围肝纤维化区域,较对照组二者表达明显增加,且红绿光分布多重叠。结论诱导HSCs运动迁移的因子表达增加和HSCs自身的运动相关蛋白表达增加均有利于HSCs运动迁移能力增强。     

降纤Ⅰ号对体外培养肝星状细胞TGF-β的影响

肝纤维化是指肝脏慢性炎症或损伤导致肝脏及内纤维结缔组织异常增生，是所有慢性肝病共有的病理改变。目前认为肝星状细胞（HSC）的活化与增生是肝纤维化进展的中心环节，有众多的细胞因子参与其中，尤以转化生长因子β（TGF-β）最为关键，为此我们拟观察降纤Ⅰ号对体外培养肝星状细胞增殖及TGF-β表达的影响。     

即刻早期基因锌指结构9在肝纤维化大鼠肝脏中的表达

目的：通过研究肝纤维化大鼠肝组织锌指结构9（zinic finger9，ZF9）基因的表达及其变化，初步探讨ZF9在大鼠肝纤维化发生中的作用。方法：雄性SD大鼠，随机分为正常组、1周组、4周组和8周组，皮下注射40％植物油四氯化碳（CCl4），并分别于注射后1、4、8周取肝组织免疫组化检测转化生长因子-β1（TGF-β1）蛋白，RT-PCR检测ZF9 mRNA水平．苦味酸-酸性品红染色观察胶原纤维表达变化。结果：（1）正常大鼠肝组织ZF9基因少量表达，模型组大鼠注射CCl4 1周后其表达增强，注射CCl4 4周后明显增强，8周时仍呈高表达。（2）正常大鼠TGF-β1在少许肝窦周细胞和汇管区部分间质细胞着色，大鼠注射CCl4 1周后，上述着色细胞增多，范围增加，注射CCl4 4周后，TGF-β1表达进一步增加，第8周TGF-β1表达更加丰富，部分肝细胞也可见表达。（3）正常肝组织几乎不表达胶原，模型组注射CCl4 1周后可见胶原有少量着色，到第4和第8周表达明显增多。结论：ZF9基因转录水平在肝纤维化的形成过程中逐渐增加．并与TGF-β1的表达同步，与胶原纤维的增加一致，可能通过活化肝星状细胞促进肝纤维化的发生。     

肝星状细胞增殖与p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的关系

背景:肝星状细胞的激活、增殖导致肝纤维化,p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路可参与调控细胞增殖。目的:探讨SB203580作用于乙醛刺激的大鼠肝星状细胞后p38丝裂原活化蛋白激酶活性变化和细胞增殖变化。方法:体外培养大鼠肝星状细胞株,在乙醛干预的基础上加入不同浓度的p38特异性抑制剂SB203580进行培养,并设置对照。以Westernblot检测磷酸化p38蛋白表达水平变化,MTT比色法检测细胞增殖。结果与结论:乙醛刺激后大鼠肝星状细胞内磷酸化p38水平增强,细胞增殖明显。使用5,10,20μmol/L SB203580能明显抑制乙醛刺激的肝星状细胞增殖(P<0.05),加大浓度至30μmol/L时,抑制作用更明显(P<0.01),抑制率为43.9%,而磷酸化p38水平也降低(P<0.05)。结果证实,抑制p38丝裂原活化蛋白激酶活性可能影响肝星状细胞的增殖。     

川芎嗪干预转化生长因子β1诱导肝星状细胞结缔组织生长因子表达中p38丝裂酶原激活蛋白激酶的途径

背景:前期研究发现川芎嚷可通过抑制肝星状细胞的增殖和阻断Ⅰ,Ⅲ胶原的合成,下调结缔组织生长因子的表达等,发挥抗肝纤维化的作用,但具体机制尚小清楚.目的:观察川芎嗪对体外培养肝星状细胞表达结缔组织生长因子的影响,以及p38丝裂酶原激活蛋白激酶(p38MAPK)信号通路在其中的作用.方法:用5 μg/L转化牛长因子β1诱导活化体外培养的肝星状细胞,用川芎嗪和p38MAPK特异阻断剂SB203580进行干预,以RT-PCR法检测结缔组织生长因子mRNA和Ⅰ型胶原mRNA的表达,Western blot法检测磷酸化p38MAPK蛋白的表达.结果与结论:经转化生长因子β1诱导后.肝星状细胞中结缔组织生长因子和Ⅰ型胶原mRNA表达显著增强(P<0.01),用川芎嗪和SB203580干预后,结缔组织生长因子和Ⅰ型胶原mRNA的表达均出现不同程度的下降.但川芎嗪和川芎嗪+SB203580混合干预对这两者的基因表达抑制作用比单独的SB203580干预更强.川芎嗪和SB203580对磷酸化p38MAPK蛋白表达也都有明显的抑制作用(P<0.01),但SB203580和川芎嗪+SB203580对其磷酸化蛋白表达抑制作用更明显,而SB203580与川芎嗪+SB203580无明显差异(P>0.05).因此,推测川芎嗪可能通过抑制转化生长因子β 1诱导的结缔组织生长因子基因表达,阻断Ⅰ型胶原合成,其作用途径可能与抑制p38mapk信号通路有关,同时认为川芎嗪抗纤维化可能是多重作用靶点.     

干扰素α-2a与肝纤维化大鼠肝星状细胞的凋亡

背景：干扰素α-2a改善肝纤维化的机制直到目前仍尚未阐明。目的：进一步验证干扰素α-2a对C14诱导大鼠肝纤维化模型中肝星状细胞凋亡的影响。方法：建立CC14诱导肝纤维化模型,健康SD雌性大鼠50只,采用随机对照原则将SD大鼠分成5组,即生理盐水对照组、纤维化模型组、6×10^4U／kg干扰素α-2a干预组、12×10^4U／kg干扰素α-2a干预组及6×10^4U／kg干扰素α-2a对照组。造模8周时取肝组织标本,分别进行肝纤维化指标检测;RT-PCR分析肝组织bcl-2、bax的表达;免疫组织化学染色用a平滑肌肌动蛋白对活化的肝星状细胞进行标记。结果与结论：肝组织病理形态显示CC14诱导肝纤维化成功建立,表现为纤维化模型组汇管区周围纤维化明显,有芒状纤维和纤维间隔形成,各干扰素α-2a干预组肝纤维化有不同程度缓解。纤维化模型组有大量a平滑肌肌动蛋白阳性表达,6×10^4U／kg干扰素α-2a干预组a平滑肌肌动蛋白阳性表达较纤维化模型组减少,12×10^4U／kg干扰素α-2a干预组更少,6×10^4U／kg干扰素α-2a对照组未见a平滑肌肌动蛋白阳性表达。结果提示干扰素α-2a能下调CC14诱导肝纤维化bcl-2的表达,及上调bax的表达。提示干扰素α-2a阻断CC14诱导肝纤维化机制存在通过调节bcl-2、bax的表达,诱导肝星状细胞凋亡途径,该调节作用可能与干扰素α-2a剂量相关。     

肝星状细胞激活相关因素的新进展

肝星状细胞的激活是肝纤维化发生发展过程中的关键步骤,肝星状细胞的活化受许多生长因子及细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白细胞介素类(IL)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和瘦素、氧化应激、核因子-κB等。现就其在肝星状细胞中的作用机制进行综述。     

肝纤维化大鼠SGK1的表达与肝星状细胞活化的关系及坎地沙坦对SGK1的影响

目的：观察血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1（SGK 1）的表达与肝星状细胞（HSC）活化的关系,并探讨选择性血管紧张素Ⅱ受体亚型AT l拮抗剂坎地沙坦对SGK 1的影响。方法：将36只W istar大鼠随机分为3组：正常对照组、肝纤维化模型组和坎地沙坦治疗组。采用复合法复制肝纤维化模型,坎地沙坦治疗组于第7周初时用大鼠灌胃针灌注药物,实验于10周末全部结束。苏木精-伊红染色法（HE法）和马松三色染色法（M asson法）观察肝组织病理学改变,应用免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（-αSM A）和SGK 1在肝内的表达及定位,并应用图像分析系统对其阳性表达结果进行半定量分析。结果：各模型组-αSM A,SGK 1的表达量较正常对照组明显增多（P〈0.01）;坎地沙坦治疗组-αSM A和SGK 1的表达量较同期纤维化模型组明显减少（P〈0.0 5）。统计结果表明二者呈正相关（r=0.899,P〈0.001）。结论：SGK 1参与了肝星状细胞的激活,坎地沙坦可以抑制肝纤维化的发展,其机制可能与HSC活化受抑、SGK 1表达减少有关。     

铁调素在肝纤维化中的表达特点及对肝星状细胞的作用

目的 观察铁调素在肝纤维化过程中的表达特点,评估铁调素对肝星状细胞(HSC)的作用及其机制。方法腹腔注射四氯化碳与橄榄油混合物诱发肝纤维化,于第0、4、8、12周后处死大鼠,动态观察铁调素在血清和肝组织中的表达特点。用不同浓度的铁调素-25多肽刺激大鼠星状细胞系(HSC-T6) 48 h,检测纤维化相关指标如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)和I型胶原在基因和蛋白质水平的表达。数据比较采用单因素方差分析与Tukey检验。结果 成功建立四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型。对铁调素的检测发现,随着纤维化进展,肝组织中铁调素的基因水平在四氯化碳注射后逐渐降低(P 0. 05);四氯化碳混合物注射后第4、8、12周铁调素的相对表达分别为0. 75±0. 12、0. 52±0. 20、0. 20±0. 10。血清中铁调素在四氯化碳混合物注射0、4、8、12周分别为(351. 45±51. 12) pg/ml、(254. 24±49. 41) pg/ml、(211. 45±42. 28) pg/ml、(189. 23±30. 24) pg/ml。体外实验表明,外源性补充铁调素(10 ng/ml、100 ng/ml)可以直接抑制HSC中纤维化相关基因(α-SMA,TIMP-1和I型胶原)的表达,且具有剂量依赖性。进一步我们发现铁调素可以通过抑制TGFβ1信号中SMAD4的表达阻断TGFβ1诱导的星状细胞活化和I型胶原的分泌。结论 铁调素水平与纤维化进展负相关,体外补充铁调素能够抑制HSC的活化并减少I型胶原的分泌。     

TGF-β1诱导肝星状细胞活化调控肝癌的炎症和免疫反应

目的通过TGF-β1诱导活化的肝星状细胞与肝癌细胞SMMC7721共培养,观察肝癌的炎症和免疫变化。方法选取厦门大学附属福州第二医院体外培养人肝星状细胞LX-2,用10μg/L TGF-β1处理LX-224 h,取活化LX-2上清液共培养SMMC7721细胞12 h后,用Disitetide处理共培养细胞,流式细胞术观察CD4+CD25+T细胞干预前后的表达变化,ELISA观察白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)干预前后的表达情况。结果 10μg/L的TGF-β1刺激LX-2后,α-SMA基因和蛋白水平表达均明显增加。活化的LX-2上清液与SMMC7721共培养后,CD4+CD25+的表达比例较SMMC7721中明显增加(P=0.003),IL-8和IL-10的表达水平也明显上调(P0.001),用Disitetide抑制TGF-β1后CD4+CD25+的表达比例较共培养组中明显减少(P=0.025),IL-8和IL-10的表达水平也明显下调(P0.001)。结论 TGF-β1可以诱导肝星状细胞活化从而促进肝癌细胞的炎症和免疫反应。     

小凹蛋白对生长抑素与姜黄素抗肝纤维化作用的影响

目的比较小凹蛋白、生长抑素、姜黄素单独及联合应用抗肝纤维化的作用并探讨其作用机制。方法将3种药物分别单独作用于大鼠肝纤维化模型和大鼠肝星状细胞。再将小凹蛋白分别联合生长抑素及姜黄素作用于大鼠肝纤维化模型和大鼠肝星状细胞。检测血透明质酸酶(HA)、Ⅳ型胶原含量(CⅣ);MTT法检测肝星状细胞增殖抑制率;免疫组化法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达。结果生长抑素及姜黄素均有抗肝纤维化作用,小凹蛋白可增强姜黄素抗肝纤维化的作用(P<0.05),但未观察到其增强生长抑素抗肝纤维化的作用(P>0.05)。小凹蛋白与姜黄素均可抑制TGF-β1表达(P<0.05),两者联用,抑制作用更强(P<0.05)。结论抑制TGF-β1可能是姜黄素与小凹蛋白抗肝纤维化的共同作用途径之一。