人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

目的诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，将其分为对照组和诱导组两组。诱导组加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导成骨。采用免疫荧光染色的方法检测碱性磷酸酶（AKP）和骨桥蛋白（0PN）的表达；并通过RT-PCR检测骨桥蛋白mRNA的表达；利用硝酸银染色和茜素红染色两种特殊染色方法检测钙盐沉积。结果经诱导，诱导组细胞在呈典型的成骨细胞形态并有钙结节形成；免疫荧光染色结果显示诱导组细胞AKP和OPN均为强阳性表达，RT-PCR结果也显示诱导组细胞骨桥蛋白mRNA表达；两种特殊染色结果显示诱导组细胞有大量的钙盐沉积。而对照组细胞无上述形态改变和表达。结论人骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能向成骨细胞分化。     

4,5,6--三羟基异黄酮对原代培养大鼠成骨细胞增殖、分化、钙含量及矿化功能的影响

背景骨质疏松症是人类老年时生活质量下降和寿命缩短的主要原因之一,而其发生与成骨细胞和破骨细胞的功能失偶联有关,因而在细胞水平上观察药物对成骨细胞功能的调整作用是评价骨质疏松症防治药物药效的方法之一.目的了解4,5,6-三羟基异黄酮(Genistein)对体外培养成骨细胞的作用.设计以大鼠成骨细胞为研究对象的随机对照单盲研究.单位一所市级医院的检验科.材料本实验于2001-02/2001-12在北京中日友好医院核医学科同位素室完成.选择10只出生24h的SD大鼠,(购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号为SCXK11-00-0008),实验室级别为SPF级.方法取小鼠头盖骨成骨细胞进行体外培养,应用四氮唑盐(MTT)法、对硝基苯磷酸盐法、原子吸收分光光度法及茜素红染色方法观察Genistein对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶表达、基质钙含量及矿化结节形成的影响.主要观察指标形态观察、增值率测定、碱性磷酸酶染色、细胞基质钙含量测定、茜素红染色显示矿化结节数.结果Genistein刺激成骨细胞的增殖,提高了碱性磷酸酶活性,细胞基质钙含量及矿化结节形成的数量增大.结论Genistein具有刺激体外培养成骨细胞增殖、分化成熟及促进矿化的作用.     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景:组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的:建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法:采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论:二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

缺氧对大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响

目的：探讨缺氧对体外培养成骨细胞的影响。方法：应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法及茜素红染色方法观察缺氧对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶（ALP）表达及矿化结节形成的影响。结果：缺氧具有抑制成骨细胞增殖，降低ALP活性及矿化结节形成的数量的作用，并随缺氧时间的增加而更加明显。结论：缺氧具有抑制体外培养成骨细胞增殖、分化成熟及延缓矿化的作用。     

脐血来源的间充质干细胞生物学特性与向成骨细胞分化能力的研究

目的研究人脐血来源的间充质干细胞（UCBMSC）的免疫表型、生物学特性及其向成骨细胞分化的能力。方法分离脐血单个核细胞，以干细胞培养液培养间充质干细胞（MSC），观察其体外生长特性；用流式细胞术进行免疫表型测定和细胞周期分析；以含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的诱导液定向诱导向成骨细胞分化；以碱性磷酸酶染色、矿化结节染色、骨桥蛋白mRNA的表达以及I型胶原表达鉴定MSC向成骨细胞分化的潜能。结果从脐血中可以培养出MSC，为成纤维细胞样的贴壁细胞。免疫表型分析显示CD45、CD34、CD11a、CD14、HLA．DR阳性细胞占1％～3％；CD166、CD44、CD106、CD29、CD105、CD49e、CD90、CD73表达率达91％～98％。细胞周期分析显示95％以上的细胞处于G0／G1期。定向成骨细胞诱导后，可以检测到碱性磷酸酶、I型胶原的表达，矿化结节的形成和骨桥蛋白mRNA的表达。结论UCBMSC是基质细胞的祖细胞，在合适的条件下可被诱导向成骨细胞分化，因此有可能作为有潜力的骨组织工程的种子细胞来源。     

帕米磷酸钠对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响

目的观察二磷酸盐类药物帕米磷酸钠对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法取新生SD大鼠头盖骨分离成骨细胞体外培养 ;不同浓度帕米磷酸钠刺激后 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测细胞增殖能力 ;取细胞上清液 ,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞培养液中碱性磷酸酶活性。结果在 10 6M— 10 12 M时 ,帕米磷酸钠能促进大鼠成骨细胞增殖 (P <0 .0 5 ) ,10 4M则抑制细胞增殖 (P <0 .0 5 ) ;帕米磷酸钠抑制大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性。结论帕米磷酸钠能直接作用于大鼠成骨细胞 ,促进其增殖 ,但抑制分化     

高糖对原代成骨细胞分化的影响

目的：观察高糖对原代成骨细胞分化和矿化功能的影响。方法：将原代成骨细胞按1×10^5接种于6孔板上。设置3组，即对照组（葡萄糖浓度为5．5mmol／L）、高糖组（葡萄糖浓度为22mmol／L）和甘露醇组（葡萄糖5．5mmol/L＋甘露醇16．5mmol／L）。于28d后检测其碱性磷酸酶（ALP）活性，运用钙沉积试剂盒检测钙沉积数值，并用实时荧光定量PCR检测I型胶原（Cog I）和骨钙素（OC）的基因表达，采用茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果：高糖条件下，ALP活性和CogI表达增高，而OC表达及钙沉积均减少，矿化结节数量减少。结论：在高糖的影响下，成骨细胞停留于分化早期，不再进一步向晚期分化，矿化功能减退，而这一作用不依赖于渗透压。     

MC3T3-E1Subclone14体外诱导成骨细胞模型的建立

目的 建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨细胞模型,为进一步了解成骨细胞形成机制打下实验基础.方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞培养至贴壁,加入条件培养基:L-抗坏血酸(50μg/mL)、β-甘油磷酸钠(10mmol/mL)、地塞米松(10-8mol/mL),培养至21d.倒置显微镜观察细胞形态;碱性磷酸酶(ALP)、Von Kossa染色鉴定成骨细胞和骨细胞;RT-PCR、Western-blot检测成骨细胞相关基因骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白等相关生物学指标mRNA和蛋白表达水平,以鉴定成骨细胞体外形成.结果 1.体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14至7d,倒置显微镜观察细胞成梭形;2.10d ALP染色结果显示:成骨细胞呈红色;3.14d Von Kossa染色结果显示:细胞表面有矿化结节形成;4.相关基因骨钙素,骨桥蛋白,骨唾液酸蛋白的mRNA和蛋白水平在14d均发生变化.结论 成功建立了MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨细胞形成模型.     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景:航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松.有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达.目的:观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响.方法:采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验.实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组.将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达.结果与结论:与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系.说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能.     

大鼠成骨细胞与壳聚糖／羟基磷灰石复合支架降解产物的生物相容性

背景：人们对壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架在体内的降解过程并非十分清楚,而且有关其降解产物对成骨细胞的影响研究也较少。目的：分析大鼠成骨细胞与壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架降解产物的生物相容性。方法：将培养的第2代大鼠成骨细胞分别在壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物浸提液和含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养,培养第2,4,6,8,10天分别对两组细胞做MTT细胞计数,采用联合会推荐法测定细胞碱性磷酸酶活性,采用BCA蛋白定量法测定总蛋白。结果与结论：在壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架降解产物浸提液中培养的大鼠成骨细胞增殖速度、细胞碱性磷酸酶活性、细胞总蛋白合成及碱性磷酸酶与总蛋白的比值明显高于在体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液中培养的细胞（P＜0.05）。表明壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架的降解产物不仅可促进大鼠成骨细胞的黏附、生长和增殖,还可增强其骨化功能,具有较好的生物相容性。     

缺氧大鼠成骨细胞增殖、分化及基因表达

背景：研究表明,低氧会引起骨折延迟愈合或不愈合,骨密度减低,使骨质疏松、骨折等疾病的发病率升高。成骨细胞是骨形成、生长和发育主要的功能细胞。目的：观察缺氧对体外培养成骨细胞增殖、分化及基因表达的影响。方法：选用新生Wistar大鼠颅盖骨,使用胰酶-胶原酶序贯消化法获取成骨细胞,进行体外传代培养及鉴定。在缺氧培养下应用MTT法测定成骨细胞增殖率,对硝基苯磷酸盐法测定成骨细胞碱性磷酸酶活性,反转录-聚合酶链反应法测定成骨细胞内骨钙素及Ⅰ型胶原的表达。结果与结论：缺氧具有抑制成骨细胞增殖,降低碱性磷酸酶活性及下调大鼠成骨细胞中Ⅰ型胶原α1、骨钙素基因表达的作用,随缺氧时间的增加作用更加明显。提示缺氧可通过抑制成骨细胞增殖、分化成熟及下调Ⅰ型胶原α1、骨钙素基因表达而降低成骨能力,从而促进骨质疏松的发生。     

低能体外冲击波和低剂量间歇甲状旁腺素干预成骨细胞的增殖和分化

背景：体外冲击波等应力刺激可促进成骨,甲状旁腺激素激素也参与调控骨代谢。目的：实验探讨低剂量间歇人重组甲状旁腺素1-34和低能体外冲击波对体外培养大鼠成骨细胞增殖及成骨分化的作用。方法：采用改良胶原酶消化法培养大鼠乳鼠颅骨来源成骨细胞备用。分别用60-150次0.18 mJ/mm2低能体外冲击波刺激体外培养大鼠成骨细胞,不同浓度（10-12 mol/L-10-10 mol/L）及作用方式的人重组甲状旁腺素1-34刺激,以及低能体外冲击波和间歇低剂量（10-11 mol/L）间歇人重组甲状旁腺素1-34刺激共同作用后,用锥虫蓝法进行细胞计数、MTT和流式细胞术分析检测大鼠成骨细胞的增殖情况;用酶标仪检测碱性磷酸酶活性,用免疫组化检测Ⅰ型胶原表达来观察大鼠成骨细胞的成骨分化。结果与结论：60-150次0.18 mJ/mm 2低能体外冲击波刺激、间歇人重组甲状旁腺素1-34（10-11和10-10 mol/L）刺激以及低能体外冲击波＋间歇人重组甲状旁腺素1-34（10-11 mol/L）刺激均可显著促进体外培养大鼠成骨细胞增殖和成骨分化（P＜0.05）,其中60-150次低能体外冲击波刺激＋间歇人重组甲状旁腺素1-34刺激各组作用最强（P＜0.05）。结果证实,适当的低能体外冲击波应力刺激和低剂量间歇人重组甲状旁腺素1-34刺激联合应用可显著促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖和成骨分化。     

小鼠成骨细胞Wnt信号通路相关因子表达与胰岛素样生长因子1的影响

背景:胰岛素样生长因子1可促进细胞增殖、分化,但其具体作用机制尚不清楚。目的:观察胰岛素样生长因子1对小鼠成骨细胞增殖﹑分化的影响,及Wnt信号通路相关因子mRNA的表达。方法:向体外培养的小鼠成骨细胞中加入25μg/L的胰岛素样生长因子1,分别于培养的第1,2,3,4,5天用CCK-8比色法检测细胞增殖率;于培养的第3,6,9天应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性;细胞培养第3天提取总RNA,采用Real-timeRT-PCR检测Wnt-3a,低密度脂蛋白受体相关蛋白5,β-catenin mRNA的表达。结果与结论:25μg/L胰岛素样生长因子1能够促进成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,而且明显增加成骨细胞中Wnt-3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白5、β-catenin mRNA的表达(P<0.05)。说明胰岛素样生长因子1能够促进成骨细胞的增殖和分化,Wnt信号通路参与了该调控过程。     

磷脂酶C-γ1对乳腺癌细胞增殖、粘附及迁移的作用

摘要：目的：探讨磷脂酶C-γ1 (phospholipase C-γ1,PLC-γ1)对乳腺癌细胞生长、粘附和迁移等生物学行为的影响,揭示乳腺癌发生的分子机制。 方法：在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中加入PLC-γ1抑制剂（U-73122）,用MTT试验、划痕试验、细胞粘附及趋化运动试验检测细胞生物学行为的变化,western blot检测抑制PLC-γ1后的信号传导通路中整合素β1和PKCζ分子磷酸化激活的情况。 结果：PLC-γ1被U-73122抑制后MDA-MB-231细胞的增殖、粘附和迁移运动能力下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。western blot结果表明,细胞粘附相关整合素β1的磷酸化激活水平降低;趋化运动相关PKCζ磷酸化水平降低。 结论：PLC-γ1参与调控乳腺癌细胞增殖、粘附和迁移运动,可能是乳腺癌分子诊断和靶向治疗的有效靶点。     

纳米级二氧化锆增韧羟基磷灰石生物复合陶瓷对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

背景:课题组拟对纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石生物陶瓷进行一些初步研究,主要集中在生物力学匹配性,化学稳定性,以及生物相容性实验,其中体外细胞培养实验具有可控性,可重复性,能很好地反映材料的生物相容性。目的:比较纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石两种材料对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法:将骨髓基质干细胞置于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基中培养,传代后改用含β-甘油磷酸钠,地塞米松和维生素C的条件培养基培养。取传至第3代的成骨细胞,以1.0×108L-1浓度接种于放有材料块的细胞培养板中,培养第1~10天倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线,并进行碱性磷酸酶活性检测。培养第6天的细胞和材料复合物用多聚甲醛固定进行扫描电镜观察。结果与结论:MTT法测得两种材料培养的细胞生长曲线无显著差异。复合培养的兔骨髓基质干细胞能够保持正常分泌碱性磷酸酶的功能。电镜照片也同样证实了两种材料表面均有细胞的附着。说明纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石均不影响成骨细胞增长分化,具有优良的成骨细胞相容性。     

小鼠成骨细胞Wnt信号通路相关因子表达与胰岛素样生长因子1的影响

背景：胰岛素样生长因子1可促进细胞增殖、分化,但其具体作用机制尚不清楚。目的：观察胰岛素样生长因子1对小鼠成骨细胞增殖﹑分化的影响,及Wnt信号通路相关因子mRNA的表达。方法：向体外培养的小鼠成骨细胞中加入25μg/L的胰岛素样生长因子1,分别于培养的第1,2,3,4,5天用CCK-8比色法检测细胞增殖率;于培养的第3,6,9天应用酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶活性;细胞培养第3天提取总RNA,采用Real-timeRT-PCR检测Wnt-3a,低密度脂蛋白受体相关蛋白5,β-catenin mRNA的表达。结果与结论：25μg/L胰岛素样生长因子1能够促进成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,而且明显增加成骨细胞中Wnt-3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白5、β-catenin mRNA的表达（P〈0.05）。说明胰岛素样生长因子1能够促进成骨细胞的增殖和分化,Wnt信号通路参与了该调控过程。     

葛根素在体外对成骨细胞增殖和分化的影响

背景:成骨细胞是骨代谢平衡过程中的关键功能细胞,植物雌激素对成骨细胞的增殖和分化有重要影响,葛根素作为植物雌激素的一种,在体外以较大范围浓度对成骨细胞功能的影响仍少见报道。目的:观察葛根素在体外对大鼠成骨细胞增殖和分化功能的影响。方法:取新生Wistar大鼠的颅盖骨,对成骨细胞进行分离、培养、纯化及鉴定。将培养的成骨细胞随机分为对照组、10-3～10-10mol/L不同浓度葛根素组,观察不同浓度葛根素对体外培养的成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性表达的影响。结果与结论:细胞经葛根素处理后10-5～10-9mol/L组成骨细胞增殖活性较对照组明显增加(P<0.05),第3天增殖最快(P<0.01),第4天开始下降;诱导第4天,各组碱性磷酸酶活性与对照组相比,差异均有显著性意义(P<0.01),其中以10-6mol/L组最显著(P<0.01)。然而葛根素10-3mol/L组成骨细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性表达较对照组均减少(P<0.05)。提示葛根素对成骨细胞的影响存在剂量依赖性,并且具有双向性,即在低浓度(10-5～10-8mol/L)下刺激骨形成;在高浓度(10-3～10-4mol/L)下抑制骨形成。     

整合素α_5β_1在成骨细胞与生物衍生材料黏附过程中的表达

背景：整合素在细胞与材料的黏附过程中发挥重要作用。目的：了解整合素α5β1在成骨细胞构建组织工程骨和组织工程骨膜过程中的表达,探讨在成骨细胞与生物衍生材料黏附过程中整合素α5β1发挥的作用。方法：选用人胚骨膜来源成骨细胞为种子细胞,接种生物衍生骨及羊膜支架材料上,制备组织工程骨及骨膜,分别培养2,4,6,8,10d。单纯培养的成骨细胞作为对照组。结果与结论：实时定量PCR测定结果,培养早期整合素α5表达呈阴性,整合素β1组织工程骨中的表达略高于组织工程骨膜,培养2,6d组比较差异有显著性意义。单纯细胞培养的对照组中,整合素β1稳定,各时间段比较差异无显著性意义。提示生物衍生材料有利于成骨细胞黏附,但在黏附过程的初期,成骨细胞可能是通过纤维连接蛋白以外的其他蛋白质完成该过程的。     

重组结核杆菌热休克蛋白10对人成骨细胞增殖及骨代谢的调节

背景：结核杆菌热休克蛋白10是引起骨结核骨质溶解和吸收主要因素之一,抑制成骨细胞的增殖。核因子κB受体活化因子配体及骨保护素是影响骨代谢的重要指标。目的：观察重组结核杆菌热休克蛋白10对人成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性和核因子κB受体活化因子配体mRNA及骨保护素mRNA表达的影响。方法：将人骨髓基质干细胞定向诱导分化筛选为成骨细胞,取第3代细胞,用含质量浓度为0.1,1,10 mg/L的重组结核杆菌热休克蛋白10培养液培养,对照组成骨细胞正常培养。结果与结论：MTT 实验结果显示,与对照组相比,不同质量浓度重组结核杆菌热休克蛋白10抑制成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性（P＜0.05）。RT-PCR实验显示,与对照组相比,不同质量浓度的重组结核杆菌热休克蛋白10均增加成骨细胞中核因子κB受体活化因子配体mRNA表达（P＜0.01）,降低护骨素mRNA表达（P＜0.01）,均呈剂量依赖性,质量浓度10 mg/L的重组结核杆菌热休克蛋白10作用最明显（P＜0.01）。结果证实,重组结核杆菌热休克蛋白10抑制成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性,通过调节核因子κB 受体活化因子配体mRNA及骨保护素mRNA表达而影响骨代谢。