虾类主要过敏原及其检测技术的研究进展

虾是一种肉质鲜美,富含蛋白质的食物,但作为主要致敏原之一,可引起不同程度的过敏反应。该文介绍虾类的过敏机制,虾类主要过敏原（原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、肌质钙结合蛋白、丙酮酸激酶、血蓝蛋白）,并综述了近几年虾过敏原检测技术的研究进展,主要包括免疫学方法、色谱与质谱联用技术、分子生物学方法和传感器技术。对虾过敏原检测技术未来的发展进行展望,以期为进一步的研究提供参考。     

虾过敏C57／BL6小鼠动物模型的建立

目的：建立C57／BL6小鼠虾过敏动物模型及其腹腔肥大细胞过敏模型。方法：运用虾蛋白粗提液免疫致敏C57／BL6小鼠,采用Western Blot鉴定致敏小鼠血清中特异性lgE和lgG1抗体;收集小鼠腹腔致敏肥大细胞（PMC）,运用虾不同的过敏原组分诱导PMC体外定向释放组胺,HPLC和荧光酶标仪法检测组胺释放水平。结果：Western Blot结果显示致敏小鼠血清IgE和IgGl与相对分子量为36ku的原肌球蛋白反应率分别为57．1％和74．1％,与80ku过敏原的反应率均为42．9％,与21ku过敏原的反应率分别为42．9％和28．6％。HPLC和荧光酶标仪法检测PMC定向释放组胺的结果无显著差异,36ku的原肌球蛋白定向诱导组胺的释放率最高,分别为18．52％和21．59％,80ku和21ku蛋白次之,表明36ku的原肌球蛋白是C57／BL6小鼠的主要虾过敏原,21ku和80ku蛋白是次要过敏原,这与人类虾过敏的状况相一致。结论：C57／BL6小鼠是一种有效的虾过敏动物模型,其腹腔肥大细胞是一种可行的检测和评价食物过敏原的细胞模型。     

凡纳滨对虾过敏原结构与性质的研究进展

凡纳滨对虾是一种营养价值高且具有致敏性的水产品,其引发的过敏反应逐渐引起研究者的重视。本文综述了凡纳滨对虾中4 种分子质量在20～80 ku范围的过敏原蛋白（即原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链以及肌浆结合蛋白）的性质、分子组成、空间结构及其各蛋白的致敏表位等诸多方面,这些将十分有益于更好了解这些过敏原蛋白的致敏机理以及降低过敏原性。     

辐照对虾过敏原抗原性的影响

目的探索辐照对海产品脱敏的效果,研究辐照对虾过敏原抗原性的影响。方法利用SDS-PAGE纯化的虾过敏原(原肌球蛋白)制备高效价、高特异性多克隆抗体,通过酶联免疫实验研究以3、5、7、10 kGy的辐照剂量处理对虾过敏原与患者特异性血清抗体IgE及多抗的免疫亲和力的影响。结果原肌球蛋白经辐照处理后,与患者特异性血清抗体IgE及鼠源多抗IgG的免疫亲和力下降。结论辐照可降低原肌球蛋白的致敏性。     

虾类过敏原的识别、纯化和检测技术研究

虾类是人类优质的食用蛋白资源之一,也是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一。虾类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量,为此开展虾类过敏原的识别、纯化和检测技术研究非常必要。通过问卷调查初步了解食物过敏现状,获取自诉虾类过敏患者血清和正常人阴性对照血清,采用特异性IgE检测试剂盒筛选虾类过敏血清。提取南美白对虾蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹识别虾类过敏蛋白,并对患者识别率最高的虾类的主要过敏原进行分离纯化。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和酶联免疫吸附测定等方法对纯化虾蛋白进行检测分析。患者识别的南美白对虾致敏原的分子质量依次约为200、175、116、85和36kDa,通过硫酸铵盐析及等电点沉淀等方法可以得到电泳纯的虾主要过敏蛋白。免疫印迹结果证实纯化的虾蛋白是具有过敏原性的原肌球蛋白,在此基础上,建立了虾原肌球蛋白的酶联免疫吸附测定方法。     

克氏原螯虾新型过敏原血蓝蛋白的鉴定及性质研究

以克氏原螯虾为研究对象,鉴定血蓝蛋白的理化性质及其过敏原性。酶联免疫吸附试验结果表明:6份甲壳类过敏患者血清与克氏原螯虾血淋巴发生特异性IgE反应,利用离心和柱层析方法从血淋巴中分离纯化到目的蛋白。SDS-PAGE分析显示纯化的目的蛋白由6个亚基(依次为68,72,76,82,84和88 ku)组成,采用兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体的免疫印迹试验证实目的蛋白为血蓝蛋白。免疫印迹试验结果显示,纯化的血蓝蛋白与甲壳类过敏患者血清出现了特异的杂交显色条带,表明血蓝蛋白具有IgE结合活性。与克氏原螯虾主要过敏原(原肌球蛋白)相比,血蓝蛋白的糖含量为1.99%,热稳定性好,pH稳定性及对胃蛋白酶的耐受性不如原肌球蛋白,但比原肌球蛋白更耐胰液消化。综合血清学及理化性质分析结果,提示血蓝蛋白是克氏原螯虾的1种新型过敏原。     

双歧杆菌对Treg/Th17细胞平衡及中国对虾蛋白致敏性的影响

目的通过体内实验研究婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis 13.085)和雷帕霉素对中国对虾原肌球蛋白致敏BALB/c小鼠过敏反应的治疗作用,从Treg/Th17细胞平衡及相关细胞因子角度探讨其缓解过敏的免疫调节作用机制。方法将中国对虾原肌球蛋白和弗氏佐剂混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏,建立动物过敏模型。将实验小鼠随机分为正常对照组、致敏对照组、双歧杆菌治疗组、雷帕霉素治疗组。观察分析小鼠过敏症状,采用ELISA测定小鼠血清中特异性IgE、IgG2a的含量,采用流式细胞术测定脾脏T淋巴细胞亚群(Treg、Th17)数量,采用荧光定量PCR测定脾脏中Treg型和Th17型细胞因子和转录因子的表达量。结果第56天实验周期结束后结果发现,相比于致敏对照组,双歧杆菌和雷帕霉素治疗组小鼠过敏症状有明显的缓解,血清中特异性IgE显著降低(P0.05),脾脏Treg/Th17比值显著升高(P0.05),Th17型细胞因子IL-17A m RNA表达水平显著降低,Treg型细胞因子Foxp3 m RNA表达水平显著升高。此外,不同剂量的雷帕霉素治疗组缓解过敏反应存在剂量差异性。结论双歧杆菌13.085和雷帕霉素能有效缓解小鼠过敏症状,其作用可能通过平衡Treg/Th17细胞亚群数量,促进Treg型细胞因子表达而抑制Th17型细胞因子分泌有关。     

主要坚果类过敏原致敏机理的初步探讨

本文以坚果过敏蛋白为抗原,构建小鼠动物致敏免疫模型,探讨坚果过敏原的致敏机理,为坚果类食物安全评价和安全开发提供有效的实验依据。选取六种坚果为原料,以昆明小鼠为受试小鼠,坚果蛋白液以0.01 mg/g进行灌胃致敏,第33 d和34 d以0.02 mg/g激发致敏,通过测定小鼠血清IgE、IgG、腹腔肥大细胞及类胰蛋白酶和血象指标,研究其病理特征。结果表明,致敏激发后小鼠IgE与IgG最高水平为0.91和0.93,组胺释放率阳性组为58%,中剂量组为40%,高剂量组为55%;小鼠腹腔肥大细胞体外激发后脱颗粒高剂量组最多以及类胰蛋白酶活性也最高;中和高剂量组、阳性组白细胞数较高(9.7±6.1、9.6±2.4、9.2±2)×109/L,低剂量组、中剂量组和高剂量组的血小板数依次降低。说明致敏后小鼠凝血功能显著减弱,免疫系统受到侵袭,体内诱发产生IgE抗体,并启动过敏介质的释放机制,导致过敏反应Ⅰ型变态反应的发生。     

甲壳类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展

甲壳类水产品味道鲜美,营养丰富,广受消费者喜爱,但可诱发机体产生严重过敏反应,甚至危及生命,已成为全球范围内日益严重的食品安全问题。概述了目前已鉴定的甲壳类水产品过敏原的结构和免疫性质,及其致敏性消减技术原理和研究进展;已报道的甲壳类水产品过敏原有原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌质钙结合蛋白、肌球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶和血蓝蛋白等,其中原肌球蛋白为甲壳类水产品的主要过敏原,可与72%~98%的甲壳类食品过敏患者血清产生特异性IgE反应。利用物理加工消减甲壳类水产品过敏原致敏性,主要通过传统热处理、微波、超高压、低温等离子体和辐照等物理作用力诱导蛋白质变性,进而破坏蛋白质的致敏性表位;酸处理和糖基化等化学修饰消减技术可以通过改变过敏原结构、形成新化学键等方式掩盖或直接破坏致敏性表位;酶处理和发酵处理等生物修饰消减技术则直接降解过敏原致敏性表位。未来仍需要通过过敏表位的靶向消减、多种消减技术协同、动物与人体试验开展,探究过敏原结构和表位修饰的影响机制,推进过敏原消减技术的实际应用,为低敏甚至脱敏甲壳类食品的研发提供参考。     

小龙虾主要过敏原精氨酸激酶的表达、纯化及 免疫原性鉴定

目的对纯化后的原核表达小龙虾主要过敏原蛋白精氨酸激酶进行免疫学鉴定。方法将化学合成的精氨酸激酶基因克隆至pET-28a(+)表达质粒上,转化进入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,使用异丙基硫代半乳糖苷进行目的蛋白的诱导表达,用Ni~(2+)亲和层析柱对重组过敏原蛋白进行纯化,使用小龙虾过敏病人混合血清对纯化后的蛋白进行免疫印迹鉴定。结果纯化得到了分子量大小约为40 kDa的重组小龙虾精氨酸激酶,并且重组蛋白与过敏病人血清IgE有明显的特异性结合。结论本实验建立了小龙虾精氨酸激酶的原核表达方法,并鉴定了其免疫原性,为小龙虾过敏的基础研究、临床诊断与治疗奠定了基础。     

虾类主要过敏原及其消减技术研究进展

虾类使消费者产生过敏反应的根源在于其含有多种过敏原蛋白。本文概述了虾类主要过敏原的种类,简要介绍了原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌质钙结合蛋白、磷酸丙糖异构酶、血蓝蛋白等致敏原特性,综述了热处理、辐照技术、酶解技术、美拉德反应以及超高压技术等在虾类过敏原消减方面的研究进展。     

蟹类主要过敏原及其消减技术研究进展

蟹是引起食源性过敏的主要食品之一,蟹类过敏原是引起蟹过敏的根源。近年来,过敏原性质的研究及分离纯化技术备受关注,已发现蟹的主要过敏原包括原肌球蛋白、精氨酸激酶、血蓝蛋白等。利用食品加工技术降低蟹致敏性的研究也日益增多,以热加工法、辐射技术、酶处理法和超高压法等为代表的蟹致敏活性消减技术取得了新进展。本文就蟹类主要过敏原的种类、致敏蛋白的制备、蟹与其他甲壳类的交叉过敏性以及蟹类过敏原消减方法等进行综述,以期为蟹过敏的诊断预防和低致敏产品开发提供参考。     

嗜酸乳杆菌对β-乳球蛋白过敏诱发Thl/Th2细胞平衡的影响

目的:观察嗜酸乳杆菌对牛乳β-乳球蛋白(BLG)致敏小鼠Th1/Th2细胞平衡及血清抗体水平的影响,以研究其缓解过敏反应的作用。方法:用牛乳BLG和弗氏佐剂的混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏,建立动物过敏模型。将实验动物随机分为空白组、过敏组与不同剂量的嗜酸乳杆菌组。采用ELISA法测定各组小鼠血清总IgE、BLG特异性IgE和总IgG含量。体外分离培养各组小鼠脾淋巴细胞,采用ELISA法检测细胞上清液中Th1型细胞因子(IL-12、IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4)的水平。结果:中、高剂量嗜酸乳杆菌组小鼠的IFN-γ/IL-4比值(代表Th1/Th2细胞平衡)显著高于过敏组(P<0.05);而其血清中的总IgE、BLG特异性IgE和总IgG水平显著低于过敏组(P<0.05),与空白组相比无差异性(P>0.05)。结论:嗜酸乳杆菌干预可改善小鼠的BLG过敏症状,其作用可能与促进Th1占优势的Th1/Th2细胞平衡,阻断IgE及IgG分泌相关。     

Dot-ELISA法同时检测多种食品过敏原的实验研究

通过花生、虾、蛋清过敏原浸液皮下免疫复制小鼠过敏模型,获特异性IgE的小鼠血清进行方法学研究。将不同的过敏原以适当浓度点状吸附于硝酸纤维素膜(NC膜)上,与待检血清作用,再依次与生物素化羊抗鼠IgE第二抗体,亲和素偶联的辣根过氧化物酶反应,DAB显色。结果表明:获得了小鼠抗花生、虾、蛋清过敏原高效价特异性IgE血清。Dot-ELISA法各种过敏原最适包被量为2μL(10μg蛋白),待检抗血清最佳稀释度为1∶80,通过肉眼观察NC膜上斑点的显色即可确定待检血清中相应过敏原特异性IgE,且3种过敏原之间无交叉反应性。不同时间同批试剂重复检测结果完全一致,包被过敏原的NC膜4℃可稳定保存3个月。实验初步建立了用含有过敏原特异性IgE的小鼠血清同时检测多种过敏原的Dot-ELISA实验方案,该法简便、特异、稳定、重复性好,可成为食品过敏原鉴定与评价的新方法。     

致敏小鼠血清代替过敏患者血清筛选Jug r 1 IgE线性抗原表位的可行性研究

目的:利用核桃过敏患者和核桃过敏原Jug r 1致敏小鼠血清筛选Jug r 1的IgE线性抗原表位,比较两者所筛选的表位的差异性,为今后利用小鼠血清替代人血清筛选食物过敏原表位提供理论依据,对食物过敏原研究及治疗具有重要意义。方法:利用固相合成肽法合成44个覆盖了Jug r 1一级序列的重叠短肽,通过圆点印迹试验利用核桃过敏患者血清和核桃过敏原Jug r 1致敏小鼠血清分别筛选出IgE抗原表位。结果:核桃过敏患者可以识别的IgE结合的线性抗原表位分别是肽段~1AALLVALLFVANAAA~(15)、4LVALLFVANAAAFRT18、~(16)FRTTITTMEIDEDID~(30)及~(125)CGISSQRCEIRRSWF~(139);核桃过敏原Jug r 1致敏小鼠所识别的抗原表位分别是1AALLVALLFVANAAA15和~(125)CGISSQRCEIRRSWF~(139)。结论:通过小鼠过敏血清筛选出的两个IgE线性抗原表位存在于过敏患者血清筛选出的4个IgE抗原表位中,提示在利用致敏小鼠血清代替过敏患者血清筛选IgE抗原表位时,可能出现假阴性结果,即有部分IgE线性抗原表位没有被识别。     

贝类精氨酸激酶致敏性的研究进展

贝类由甲壳类动物和软体动物组成,随着贝类过敏日益增多,贝类过敏原逐渐成为一项重要的研究领域。精氨酸激酶(AK)是贝类中的过敏原之一,关于AK的研究主要集中在酶学性质及分子克隆方向, AK的致敏性方面研究较少,而分析其致敏性的关键是系统认识AK的抗原表位,其表位的确定有利于了解相关过敏反应机制。因此,对贝类过敏、贝类精氨酸激酶及其致敏性的研究进展、抗原表位进行论述,并对精氨酸激酶的研究方向进行展望,以期为更好地研究贝类AK的致敏性和开发低致敏甚至无致敏性贝类食品提供参考。     

水产品过敏原及其消减方法研究进展

水产品在人类营养和健康中扮演重要角色。随着水产养殖业和国际贸易的发展,其市场和消费群体不断增多;由此水产品引发的过敏问题也逐渐增多,已成为世界性的重大食品安全问题之一。水产品的主要过敏原是小清蛋白(parvalbumin)和原肌球蛋白(tropomyosin,TM);另外,卵清蛋白、胶原蛋白(collagen)、精氨酸激酶(arginine kinase)、肌球蛋白轻链(myosin light chain)、肌钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding pro-tein)等过敏原也扮演重要角色。基于此本文综述了水产品过敏原致敏机制、过敏原的种类、水产品致敏性的消减方法,并展望了水产品过敏原今后的研究方向和发展趋势。     

克氏原螯虾过敏小鼠动物模型的构建研究

为了更好地研究食用克氏原螯虾引发的食物过敏情况,利用Balb/c小鼠构建了食物过敏动物模型,提取克氏原螯虾过敏原蛋白,采用皮下注射致敏方法,考察致敏相关的效应因子组胺含量和致敏IgE抗体产生情况,并测定致敏过程中的细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的含量,结合生理性状观察,对模型质量进行评价,结果表明,经注射致敏后,小鼠产生较多的特异性IgE抗体,血清中组胺含量也大量产生,与之相关的效应因子IL-4和IL-6均显著提高,而同时IFN-γ的含量明显减少。该研究为进一步开展克氏原螯虾食用过敏的研究提供帮助。     

蟹类主要过敏原的模拟肠胃液消化及其对过敏原活性的影响

目的:通过模拟肠胃液消化试验,分析锯缘青蟹肌肉中过敏原(原肌球蛋白)的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响.方法:采用美国药典提供的模拟胃、肠液配方,测定青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性.以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行分析.结果:在模拟胃液反应中,非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白等被胃蛋白酶快速降解,而原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解.在模拟肠液反应中,相对于致敏蛋白,肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解,原肌球蛋白尽管120 min后几乎被完全分解,但会产生一些较稳定的蛋白降解片段.以免疫印迹法检测过敏患者血清,结果分子质量为34 kDa的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性.结论:蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性,而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应.     

肥大细胞组胺体外释放模型在食品过敏原分析中的应用

目的：应用本室的肥大细胞组胺体外释放模型,分析食品过敏原中不同致敏组分的致敏差异性,验证建立的过敏原体外评价新方法。方法：牛奶、虾粗提物分别免疫C57／BL6小鼠,收集小鼠腹腔致敏肥大细胞（PMC）,分别用牛奶、虾不同过敏组分诱导PMC释放组胺,荧光法检测其释放水平。结果：牛奶中酪蛋白诱导牛奶致敏PMC释放组胺最多,脱脂乳和乳清次之,α-La则最少。酪蛋白是牛奶致敏蛋白中主要组分。虾致敏蛋白中,以80kD蛋白诱导组胺最多,36kD蛋白次之,21kD蛋白最弱,虾致敏蛋白混合诱导明显比单独诱导释放组胺多,说明80kD蛋白在虾致敏蛋白中起主要作用,并且各致敏蛋白间存在协同效应。结论：肥大细胞体外组胺释放量与过敏原种类及量存在相关性,本研究为进一步建立研究食品过敏和食品过敏原的新模型系统奠定基础。