PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

MAGE-3 原核重组表达载体的构建和表达

 目的 构建原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E.coli）BL21中的表达。方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pGEM-TEasy和亚克隆至pGEX-4T-1载体,转化E.coliBL21株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果 扩增出349bp的MAGE-3目的基因并构建了原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与Gen Bank收录序列相一致;在E.coli BL21中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的蛋白。结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据。     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

在CerbB-2表达不同的乳腺癌组织中Maspin的表达

目的　对CerbB 2表达不同的乳腺癌组织中肿瘤抑制基因Maspin的表达变化进行比较研究。方法　采用免疫组化SP染色法检测2 9例乳腺癌组织中Maspin蛋白的表达情况。结果　Maspin蛋白在CerbB 2阴性表达的乳腺癌组织中的高表达率为47% (7/15 ) ,在CerbB 2阳性表达的乳腺癌组织中的高表达率仅为7% (1/14 ) ,两者有显著性差异(P <0 .0 5 )。结论　在CerbB 2表达不同的乳腺癌组织中Maspin表达亦存在显著差异,Maspin也可作为判定乳腺癌恶性程度及预后的指标。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

结肠癌组织中癌症高表达蛋白的表达及其临床意义

目的:探讨结肠癌组织中癌症高表达蛋白(Hec1)的表达与肿瘤浸润、转移及预后的关系.方法:采用免疫组化SP法检测20例正常结肠组织、40例癌旁组织及癌组织中Hec1的表达,用蛋白印迹法检测上述组织中Hec1蛋白的表达.结果:在正常结肠组织、癌旁组织及癌组织中,Hec1蛋白的阳性表达率分别为0、20.0%和67.5%,各组织中Hec1蛋白的表达差异均有统计学意义,P<0.05.Hec1蛋白的表达与结肠癌的临床病理分期、侵袭转移显著相关,在发生淋巴道转移及低分化的肿瘤组织中,Hec1蛋白高表达.蛋白印迹法结果表明,在正常结肠组织、癌旁组织及癌组织中,Hec1蛋白的平均表达量的分别为0、0.13±0.02、0.87±0.15,差异有统计学意义,P<0.05.结论:Hec1蛋白的过度表达可能在结肠癌的发生和发展中起重要作用,联合应用Hec1蛋白阳性表达率与其临床病理学分级,有助于正确判断患者的预后.     

GFP-hTRAIL融合蛋白表达质粒的构建与卵巢癌细胞内表达

目的构建GFP-hTRAIL融合蛋白表达质粒,测定其在卵巢癌细胞中的表达.方法以GFP基因为报告基因,hTRAIL为目的基因,将hTRAIL基因插入GFP基因上游,构建成GFP-hTRAIL融合基因表达质粒,并通过酶切和测序对重组体进行鉴定.经脂质体法转染培养的卵巢癌细胞,用荧光显微镜观察GFP 的表达.流式细胞仪分析转染后卵巢癌细胞的凋亡率.结果测序结果证实构建的为GFP-hTRAIL融合基因表达载体.质粒经脂质体转染后,有大约20% 的卵巢癌细胞表达融合蛋白.流式细胞仪结果表明转染该质粒可诱导卵巢癌细胞凋亡.结论构建了1个可以表达GFP-hTRAIL融合蛋白的新质粒,该表达载体的构建成功为进一步开展卵巢癌的基因治疗奠定了基础.     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

乙肝病毒 X基因真核表达载体的构建及表达

目的：探讨HBVX基因在肝癌发生中的作用,并构建含X基因真核表达质粒。方法：用PCR法扩增含EcoRI与P stI 酶切位点的X基因序列,对PAS2－1载体及X基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105,对得组质粒经序列测定,称PAS2－1X。用乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌AH109,经Western blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒AS2-1X经序列测定含有完整的 X 基因片段,转入酵母后经Western blot证实酵母细胞表达X蛋白。结论：PSA2－1X表达载体是为了解X基因与X蛋白的致癌机制而构,为通过酵母双杂交体系筛选体内与X蛋白相互作用 的X相关蛋白奠定了基础。     

小鼠SLC基因真核表达载体的构建及表达

次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)是重要的CC趋化因子,对多种免疫细胞特别是T淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)及NK细胞具有趋化作用.研究证实,SLC通过募集T淋巴细胞、DC和NK等免疫效应细胞到肿瘤组织、促进细胞因子的释放以增强肿瘤局部非特异性免疫以及抑制肿瘤血管生成等作用,达到其显著的抗肿瘤效果,是目前肿瘤免疫治疗的理想效应分子.为了进一步探索SLC在肿瘤基因治疗中的应用,我们构建了小鼠SLC基因的真核表达载体pVAX1-mSLC,为今后开展体内基因治疗肿瘤奠定基础.     

小鼠白介素-12真核表达质粒的构建及其表达

目的:构建能在真核细胞内稳定表达小鼠白介素-12(mIL-12)的质粒,为进一步研究mIL-12的免疫调节机制及其抗肿瘤作用奠定基础。方法:通过聚合酶链反应(PCR)扩增质粒pORF-mIL-12(Elas-ti),双酶切后将目的片段mIL-12连接到真核表达载体pcDNA3.1( )质粒上,mIL-12受pcDNA3.1( )中mCMV启动子驱动,将mIL-12全长转录至同一mRNA上,对重组质粒进行鉴定后将其转染小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)测其表达。结果:PCR成功扩增出mIL-12片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序均证实pcDNA3.1( )-mIL-12质粒构建成功,RT-PCR及ELISA证实重组质粒在mRNA及蛋白质水平均高表达mIL-12。结论:pcDNA3.1( )-mIL-12真核表达质粒构建成功并能在LLC细胞中稳定表达。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

Maspin在肿瘤中的表达与反表达

Maspin（Mammary-serpin）是1994年Zon等使用消减杂交（sub—tractive hybridization）的方法在对正常乳腺和乳腺癌组织进行比较研究时发现的,它是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）超家族的成员。大量研究表明,Maspin基因是一种肿瘤抑制基因,在多种肿瘤如乳腺癌、前列腺癌中表达下调或缺失,其通过多种机制抑制肿瘤细胞的生长,诱导其凋亡,抑制肿瘤新生血管的生成等;但也有一些文献报道,Maspin在多种肿瘤中呈反表达,如在卵巢、胃的肿瘤中表达呈上调趋势。这两种截然相反的结论,使得人们对Maspin作为一种抑癌基因及其抑癌功能提出了质疑。总之,对Maspin基因表达机制和功能还有待进一步深入的探讨。     

胃癌E-Cadherins表达的研究

目的：研究钙离子依赖细胞-细胞间粘附分子E-Cadherins（Eg和Uvomorulin）在不同生长方式胃癌中的表达，探讨胃癌的闵锡钧分类。方法；应用单克隆抗体，免疫组织化学技术对46例新鲜胃癌标本中E-Cadherins进行检测。结果：E-Cadherins在胃正常小凹上皮细胞，慢性胃炎小凹上皮细胞和肠化腺体中呈均质性表达，然而在胃癌细胞中却出现异质性减少至消失的表达，这种表现尤其存在于闵锡钧分类的浸润型生长方式胃癌（24／24，100％）和分化不良的胃癌（2／31，84％），且呈分散单个浸润的胃癌细胞明显缺乏这种粘附分子。结论：E-Cadherins的存在与否可能决定着胃癌的生长方式和分化程度，它可以解释胃癌闵锡钧分类发病机理的～个方面。     

食管癌细胞系SLP-2基因的表达及其荧光表达载体的构建

目的：研究SLP-2基因在食管癌细胞系中的表达及其功能发生的具体分子机制。方法：运用West-ern-blotting检测SLP-2在TE12细胞系中的表达。利用PCR从TE12细胞的cDNA中扩增SLP-2的开放阅读框,定向连接到pEGFP-N3载体,并通过细胞免疫荧光实验检测SLP-2蛋白在TE7细胞内的表达。结果：SLP-2基因在TE12细胞中高表达,并成功构建pEGFP-N3-SLP-2荧光表达载体,SLP-2蛋白主要定位在细胞质内。结论：证明了SLP-2在食管癌细胞中高表达,其荧光表达载体的构建为进一步研究SLP-2在食管癌发生发展的分子机制奠定了基础。