禽多杀性巴氏杆菌X-73株ompH基因的克隆和表达

以禽多杀性巴氏杆菌国际标准株X-73基因组DNA为模板,采用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟外膜蛋白H的ompH基因,将ompH基因克隆至pMAL-p2X表达载体中,构建重组表达质粒pMAL-p2X-ompH,转化大肠杆菌BL21,用SDS-PAGE电泳检测IPTG诱导后的表达蛋白.DNA测序结果表明ompH基因片段大小为1 002 bp,与已报道的ompH基因的核苷酸序列完全相同、而SDS-PAGE结果显示表达分子质量约为78 ku,与预期的融合蛋白MBP-OmpH分子质量相符,表明成功构建出原核表达质粒并实现了目的蛋白表达,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌保护抗原的研究奠定基础.     

禽巴氏杆菌株粘附蛋白基因的克隆和序列分析

用PCR从禽巴氏杆菌P-1059基因组DNA中分别扩增编码粘附蛋白OmpH,PtfA,PlpE和PM1665的基因序列,将PCR产物克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR筛选含有重组质粒DNA的重组子,并对目的基因进行测序.DNA测序结果表明,P-1059株ompH,plpE,ptfA和pm1665基因大小分别为1 032,1 008,435,348bp,分别编码343,335,144,115个氨基酸的多肽.Blast分析结果显示,P-1059株与已报道不同血清型巴氏杆菌ompH基因的同源性为95%~97%,与ptfA基因的同源性为95%~99%,与plpE基因的同源性为94%~97%,而与pm1665基因的同源性为99%.克隆得到的ompH,ptfA,plpE和pm1665基因,为禽巴氏杆菌粘附因子及其致病机理的研究奠定基础.     

鹌鹑巴氏杆菌人工发病试验及病理形态学观察

作者选用禽多杀性巴氏杆菌(C_(48-1))株人工发病试验,结果表明:鹌鹑对禽多杀性巴氏杆菌具有强的易感性,不论是经消化道还是肌肉注射均导致急性感染经过。同时发现,24小时内死亡者均为败血症死亡,超过24小时死亡者,实质器官具有一定的特征性病变。从组织学检查还发现,组织坏死性变化似乎由一单细胞坏死发展到多个细胞坏死的不同程度的演变过程。     

禽病消对禽多杀性巴氏杆菌的体外抑菌试验

本试验应用体外抑菌试验的试管法对复方敌菌净、喹乙醇单方和两药复方(禽病消)对禽多杀性巴氏杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)进行了测定.单方时复方敌菌净和喹乙醇的MIC分别为48μg/ml和6μg/ml,MBC分别为120μg/ml和15μg/ml,复方制剂(禽病消)中的复方敌菌净和喹乙醇的MIC分别为3.84μg/ml和0.84μg/ml,MBC分别为24μg/ml和3μg/ml,FIC指数为0.16,禽病消对禽多杀性巴氏杆菌的抗菌作用较复方敌菌净、喹乙醇两药单独应用时增强了12.5—32倍,结果说明:复方敌菌冷与喹乙醇联合应用具有明显的协同作用,禽病消组方合理,是防治禽巴氏杆菌病的有效复方新制剂.     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

兔、禽多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的研制

该项目特点为制苗菌株经多年筛选,毒力强,免疫原性好.用其免疫兔、鸡,可抗不同血清型强毒的攻击,对兔、禽均有较好的免疫保护力.又由于是灭活疫苗,故安全性好,还适宜于在疫区用于紧急预防接种,且在免疫的同时也不影响使用抗生素.     

攀西地区禽沙门氏菌病和巴氏杆菌病实验室诊断

对攀西地区七个县市20个养禽场共计50余万只家禽进行为期3年疾病实验室诊断跟踪调查,结果显示:禽沙门氏菌病和巴氏杆菌病占攀西地区家禽疾病的70％以上,是攀西地区危害家禽最严重的两大疾病。     

雏鸭鸭疫巴氏杆菌和多杀性巴氏杆菌混合感染的诊治

对成都市郊某肉种鸭场爆发的雏鸭疾病，通过流行病学调查、临床症状、病理变化观察、病原分离鉴定、确诊为鸭疫巴氏杆菌和多杀性巴氏杆菌混合感染．在药敏试验的基础上，对１７００多只病鸭用两菌高度敏感的抗菌药物进行治疗，疗效显著，治愈率达９８％．     

枯草芽孢杆菌TF2磺胺胍抗性基因的克隆和表达

采用鸟枪法将枯草芽孢杆菌磺胺胍抗性基因克隆到质粒ｐＵＢ１１０中建成重组质粒,ｐＢＵＷ４,该质粒的分子量约８．１ｋｂ,标记为ＳＧ＾ｒ为Ｋｍ＾ｒ,将ｐＵＢＷ４转化到肌苷产生菌枯草芽孢杆菌Ｑ２９０１－４菌株中,得到的转化子产肌苷能力比受体菌提高２５．５％。     

La多肽的基因克隆和表达

以人脾ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ获得Ｌａ多肽（全长）的ＤＮＡ片段。将此片段利用双酶定向克隆到ＭＢＰ（麦芽糖结合蛋白）融合系统的载体ｐＭＡＬＴＭ－ｃ中得以表达。经免疫印迹实验证明，表达后的产物具有Ｌａ多肽的特异性，敏感性则超过生化制备的ＥＮＡ制品。     

EDSV六邻体蛋白基因克隆与原核表达载体构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上,经酶切、PCR鉴定及测序结果表明插入的片段为目的基因,全长2．733kb,共编码910个氨基酸。切下该目的基因定向克隆至pET-28a质粒构建了六邻体蛋白基因原核表达载体pET28a-hexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序后证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的表达及进一步阐明EDSV六邻体蛋白基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好基础。     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

SARS病毒E基因的克隆及原核表达

为了得到纯的SARS-CoV E蛋白以进一步研究其功能,通过Touch-down PCR程序,从SARS-CoV WHU cDNA(pMD18-T载体)文库中扩增了E基因,构建了重组质粒pGEX-E,并在Ecoli DH5α中进行了原核表达。SDS/PAGE及Western blot结果表明SARS病毒E蛋白的分子量约5 kDa,较预测的略小,并进一步分析了这种现象产生的可能原因。     

植物抗病基因克隆的研究进展

植物抗病基因的分子生物学研究已成为一个热点，抗病基因克隆研究突飞猛进的发展展示了诱人的应用前景。分别从功能克隆、定位克隆、序列克隆和表型克隆4个方面分析讨论了植物抗病基因克隆的研究进展，指出了存在的问题及今后可能解决的策略。     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白cDNA的克隆和原核表达载体的构建

目的克隆SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白.方法用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET30a表达载体.结果实现了SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆.结论可以对重组成功的pET30a-N进行进一步的应用.     

广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列克隆及序列分析

目的克隆广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列,并与已发表的其它品种猪的生长激素(pGH)基因全序列进行比较,探讨该基因在广西巴马小型猪中可能存在的变异。方法以广西大学巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增巴马小型猪生长激素基因的全序列,将该扩增片段亚克隆到pMD18-T载体后测序。再将测序结果在NCBI进行BLAST。结果测序结果证明克隆得到了巴马小型猪GH基因,全长为2 007 bp。同源性比较发现,巴马小型猪GH基因全序列与GenBank中发表的五指山猪、太湖猪及普通猪的GH基因全序列的同源性分别为99.4%、98.3%、93.9%。