猪链球菌国内分离株毒力因子的分布特征

为了研究国内致病性猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的毒力因子分布特征,本试验选取猪链球菌7种主要毒力因子—谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关序列orf2,设计并合成7对引物,用PCR方法进行检测。结果显示:25株猪链球菌2型(SS2)国内分离株,96%(24/25)表现为cps /gdh /epf /mrp /sly /fbps /orf2 ,仅1株表现为cps /gdh /epf-/mrp /sly /fbps /orf2 ;1株猪链球菌1型(SS1),表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;1株猪链球菌7型(SS7)国内分离株,表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;2株猪链球菌9型(SS9)国内分离株,均表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly-/fbps-/orf2 ,可见国内SS2的毒力基因分布特征与欧美等国家明显不同,提示我国目前SS2的主要流行菌株是同时具有7种毒力因子的高致病菌株。     

多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子

根据猪链球菌基因序列,设计合成10对引物,通过在3个反应体系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的组合优化,建立涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的快速敏感的多重PCR检测方法.对不同菌株检测结果显示,该多重PCR方法特异性强、敏感性高,能快速检测出猪链球菌2、7、9型及其毒力因子表型,可用于快速诊断及猪链球菌的分子流行病学调查.     

两株猪链球菌血清9型菌株的生物特性分析

为了解猪链球菌血清9型菌株KQ-1株、KQ-2株的生物特性,对其进行了菌种鉴定、生长曲线绘制、毒力因子鉴定和小鼠致病性试验.首先采用革兰氏染色、PCR鉴定的方法对2株菌进行菌种鉴定,然后利用猪链球菌的主要毒力基因mrp、epf、sly、gadph、orf2、fbps、89k的引物对2株菌的毒力基因进行鉴定;将2株菌在TSB培养基(含10％新生牛血清)中进行培养,绘制其生长曲线,初步了解这2株菌的生长特性;选取45只健康的昆明鼠注射2株菌的菌液,进行致病性试验,了解其致病性.结果显示,KQ-1株、KQ-2株革兰氏染色呈阳性,PCR鉴定结果为猪链球菌血清9型;2株菌均在37℃培养6 h时菌液密度达到最高值.对2株菌毒力基因的鉴定结果如下:KQ-1株的基因型为mrp+/epf-/sly+/gadph+/orf2-/fbps-/89k-,KQ-2株的基因型为mrp-/epf-/sly-/gadph+/orf2+/fbps-/89k-;对2株菌的小鼠致病性试验表明,2株菌均为强毒株.     

正常屠宰猪致病性猪链球菌7型的鉴定和特性研究

从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌,命名为HA100111.该细菌呈链球菌的特征形态,药敏试验表明该菌株对多种抗生素有耐药性.经PCR及序列分析,确定该分离菌株为猪链球菌7型,其毒力因子基因型为gdh +/mrp -/epf-/sly -/orf2 +/fbps+.动物致病性试验表明,该菌对ICR小鼠和新西兰兔有较强的致病性,对ICR小鼠半数致死量为2.67 ×107 CFU,但是对仔猪无明显致病作用.得出结论,在正常猪扁桃体中可携带致病性的猪链球菌7型.     

东莞某屠宰场猪链球菌检测及分离鉴定

【目的】猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种重要的猪病原菌,也是一种人兽共患病病 原体。其中猪链球菌 2 型（SS2）致病力最强,不但引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎甚至死亡,也可 导致人的感染和死亡。为评估屠宰场猪链球菌的传播风险,对东莞某屠宰场进行猪链球菌的采样检测和分离 鉴定。【方法】采集 40 头猪的关节液和扁桃体进行 PCR 检测和猪链球菌分离,分离菌分别进行形态学和生 理生化鉴定、16S rDNA PCR 扩增、分型 PCR 检测和抗生素敏感性试验。【结果】 对 40 头猪的关节液和扁桃 体提取 DNA 进行 PCR 检测,在 40 份关节液中,猪链球菌阳性率为 22.5%,但未检出猪链球菌 2 型阳性;在 40 份扁桃体样品中,猪链球菌阳性率为 32.5%,其中猪链球菌 2 型阳性率为 7.5%。从 40 头猪的扁桃体和关 节液共 80 份样品中分离出 3 株猪链球菌, PCR 结果表明,3 株分离菌中 1 株为猪链球菌 4 型,基因型为 epfmrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly-;其他 2 株为猪链球菌 9 型,基因型分别为 epf-mrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly- 和 epf-mrp-gdh+gapdh+fbps-orf2+sly+。药敏试验表明,3 株猪链球菌菌株对青霉素 G、林可霉素、多粘菌素 B 和磺胺异恶唑耐药,对恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素和阿莫西林敏感。【结论】该屠宰场猪群中存在猪链球 菌的隐性感染,提示存在猪链球菌 2 型感染人的风险。     

1株猪链球菌的分离·鉴定及其毒力因子研究

[目的]对1株疑似猪链球菌菌株进行鉴定,为进一步研究猪链球菌的毒力提供理论基础。[方法]采用革兰氏染色镜检、形态观察和16S rDNA测序后NCBI数据库Blast比对鉴定菌株;另外选取猪链球菌7种主要毒力因子设计引物,利用PCR方法检测其毒力基因分布情况。[结果]显微镜下该疑似菌株为革兰氏阳性菌,多数呈链状,少见单个排列。16S rDNA测序结果与猪链球菌2型同源性达到99%。毒力因子检测均含有7种毒力因子。[结论]该疑似菌株为猪链球菌2型,其毒力基因型为：gdh＋/ef＋/mrp＋/sly＋/fbps＋/orf2＋/cps2J＋/。     

PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp epf ) ,1株为 mrp epf- ,1株为 mrp- epf- 。     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。     

浦东地区部分猪场猪链球菌2型的分离鉴定及耐药性分析

2014年03月至08月期间,对来自浦东地区患关节炎的150份病猪和死猪内脏器官及关节液进行细菌分离,对分离细菌进行革兰氏染色、PCR鉴定、药敏实验和多重PCR检测链球菌毒力因子分布(荚膜多糖cps、溶菌酶释放蛋白基因mrp、胞外因子ef、溶血素sly、毒力相关基因orf2、谷氨酸脱氢酶基因gdh、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapdh),并对链球菌2型cps基因序列进行进化树分析。结果,从分离到的120株细菌中检测到21株链球菌,分离率为17.5%,2型链球菌分离率为11.67%;链球菌的毒力型呈-/+cps2J-/+mrp-ef-sly-gdh-/+gadph-/+orf2;分离株呈多重耐药性,耐药性为:大环内酯类硝基呋喃类、氯霉素类、多肽类、氨基糖苷类、四环素类青霉素类、头孢菌素类、亏诺酮类林可胺类、磺胺类;cps基因与GenBank上已公布的链球菌2型荚膜多糖基因的核苷酸同源性达94%~99%。     

贵州省铜仁地区猪链球菌2型的分子流行病学分析

目的:调查分析贵州省铜仁地区的猪群中猪链球菌2型的带菌情况和毒力因子的分布情况。方法:研究采用从贵州省铜仁地区各屠宰场收集的150份猪扁桃体样本,对分离菌株进行培养,通过生化鉴定确定当地的猪群带菌情况,并使用PCR方法对猪链球菌2型的主要致病毒力因子进行检测。结果:检测显示,150例样本中2型猪链球菌带菌率达到41.3%,其中屠宰场3的检出率较高,mrp、epf片段与阳性对照相关基因的同源性达到100%,屠宰场3的所有样本mrp、epf毒力因子均表现为阳性。结论:该地区猪群猪链球菌2型携带率较高,mrp、epf毒性因子阳性表现型与疫病的流行可能存在一定的关联性。     

猪链球菌亚种及1、2、9型四重PCR检测方法的建立

根据序列分析设计了4对引物,分别扩增猪链球菌gdh、cps1、cps2J和cps9G基因的725、212、387bp和556bp大小的片段,利用合成的4对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了四重PCR,结果显示,猪链球菌阳性出现1条725bp目的带,猪链球菌1型阳性出现725bp和212bp两条目的带,猪链球菌2型阳性出现725bp和387bp两条目的带,猪链球菌9型阳性出现725bp和556bp两条目的带。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1095株,检出猪链球菌阳性667株、猪链球菌1型8株、2型33株、9型16株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学研究。     

猪链球菌分子生物学检测研究进展

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原.目前,PCR是检测猪链球菌最常用的方法.可以通过扩增猪链球菌特有的基因片段(cps、gdh)等鉴定出猪种链球菌,然而很多新分离的菌株还无法用PCR方法进行鉴定.新的分子生物学检测方法在基因的水平上.对猪链球菌新分离菌株进行定型和阐述猪链球菌毒力株与无毒力株之间的差别的运用发展越来越快.     

猪源致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及抗菌药耐药性的调查

【目的】探讨猪大肠杆菌病分离的E.coli的优势血清型与毒力基因和耐药性的相关性。【方法】采用玻片凝集法测定了猪大肠杆菌病有关的血清型分布,PCR方法调查7种毒力相关基因,用微量稀释法测定了所有菌株对18种抗菌药的敏感性。【结果】超过一半的菌株含有astA,Stx2e和eaeA基因,且毒力基因组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行。定型菌株53株,分别属于15个不同的血清型,其中O8和O64为主要流行的血清型。O8型菌株中,所有均携带astA基因,多数耐四环素、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑,但对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感;而O64型菌株中,多数携带astA和Stx2e基因,所有对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑耐药,但对多黏菌素E和卡那霉素敏感。【结论】O8和O64为主要流行的血清型,两种血清型菌株拥有相似的毒力基因谱和耐药表型,但有不同的敏感表型。     

猪链球菌2型毒力因子gapdh基因的克隆·表达及与Hela细胞互作蛋白的筛选

[目的]克隆并在大肠杆菌中表达猪链球菌2型毒力因子gapdh基因,寻找与GAPDH互作的受体蛋白.[方法]扩增猪链球菌2型甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh基因并构建表达质粒pET28a-gapdh.[结果]在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达了约41 kDa的融合蛋白GAPDH.Western blot试验说明GAPDH具有良好的免疫学活性.利用新西兰大白兔制备抗GAPDH蛋白的多克隆抗体.运用配体重叠技术,在HeLa细胞中初步找到了一个与GAPDH蛋白作用的潜在受体蛋白.[结论]为进一步研究猪链球菌2型的分子致病机理奠定基础.     

湖北地区猪链球菌2型的鉴定及生物学特性研究

以湖北荆州地区疑似猪链球菌病的病猪为研究对象,经病料采集、细菌分离培养、纯化、染色、镜检、生化鉴定、血清学试验和PCR检测,确定该病猪为猪链球菌2型病例。经药敏试验筛选出了环丙沙星、阿莫西林和头孢唑肟钠为其敏感药物;经动物攻毒试验复制出同样疾病,表明猪链球菌2型对湖北地区猪具有很强的致病性。     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失株的构建

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素（cat）选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H（△IMPDH）对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H（△IMPDH））对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108 CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108 CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H（△IMPDH）,并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。