日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组...     

日本血吸虫调宁蛋白样蛋白P14基因DNA疫苗对小鼠免疫保护作用研究

摘 要：目的 研究日本血吸虫调宁蛋白样蛋白P14基因DNA疫苗对小鼠免疫保护作用。 方法 制备无内毒素DNA疫苗,用于免疫小鼠。将雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只。生理盐水组给予100 μl/鼠/次;空质粒组100 μg/鼠/次、pcDNA3.1(+)-SjP14组、pcDNA3.1(+)-SjP14 + pcDNA3.1(+)-SjGST组分别经肌肉给予100 μg/鼠/次;同上每2周免疫一次,共3次。末次免疫后2周,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（30±1）条/鼠。尾蚴攻击6周后解剖小鼠,收集成虫和血清,计算减虫率并检测血清IgG1、IgG2a及总IgG;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率,部分肝脏用于组织病理学分析（HE染色法）,观察肝细胞变化及肉芽肿情况。结果 与NS对照组比较,pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗组减虫率和减卵率分别达到45.1%（P<0.05）和62.0%（P<0.001）;SjP14核酸疫苗与SjGST核酸疫苗联合免疫组减虫率和减卵率分别提高至56.3%（P<0.01）和73.9%（P<0.001）;SjGST和SjP14 组减虫率大于SjP14疫苗组,但两组之间差异无显著性（P＞0.05）; SjGST和SjP14组减卵率明显大于SjP14疫苗组, 两组之间差异有显著性（P<0.001）。SjGST和SjP14组与SjP14组血清IgG1、IgG2a及总IgG水平在免疫6周、12周后均较对照组显著提高（P<0.01）,但SjGST和SjP14组与SjP14之间差异无显著性（P＞0.05）。肝组织切片镜下显示,pcDNA3.1(+)-SjP14组肝脏病变较生理盐水组和空质粒组明显减轻,pcDNA3.1(+)-SjP14 + pcDNA3.1(+)-SjGST组肝脏损伤程度最轻,虫卵肉芽肿周围炎症反应轻,肉芽肿面积较小。结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14与pcDNA3.1(+)-SjGST疫苗联合免疫能增强小鼠对血吸虫感染的保护。     

核酸疫苗PcDNA3.1/SjTs-1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染保护力的研究

目的探讨日本血吸虫核酸疫苗pcDNA3.1/SjTs-1粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力.方法小鼠随机分为5组,每组12只,包括单磷脂A(MPL)、pcDNA3.1、pcDNA3.1 MPL、pcDNA3.1/SjTs-1和pcDNA3.1/SjTs-1 MPL组.滴鼻免疫.第3次免疫后2周,每只经腹部感染(40±1)条尾蚴.45 d宰杀动物,以观察减虫率和减卵率.在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血和收集粪便,ELISA检测血清内特异性IgA和IgG及粪内sIgA水平.结果pcDNA3.1/Sjs-1滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答,且疫苗加佐剂组诱导小鼠产生的抗体水平高于不加佐剂组.pcDNA3.1/SjTs-1和pcDNA3.1/SjTs-1加MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为24.98%和25.57%,减卵率分别为61.44%和64.59%.两者的减虫率和减卵率差异无显著性(P＞0.05).结论pcDNA3.1/SjTs-1滴鼻免疫可诱导小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗攻击感染的保护力.     

重组Sj14-3-3,SjGST及mIL-12/聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)缓释微球对小鼠免疫保护性的研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球给药系统在血吸虫病分子疫苗中的应用,并探讨rSj14-3-3,rSjGST及mIL-12作为疫苗的协同作用,及mIL-12刺激机体产生CTL和辅助性T细胞(Th)在抗血吸虫病中的作用。方法从pET28a/Sj14-3-3和GST重组质粒中诱导表达rSj14-3-3及rSjGST,过柱纯化。构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)mIL-12,并共同包入PLGA缓释微球。对制备的微球进行体外释放,观察其释放速度。分组免疫BALB/c小鼠,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6w后,剖杀小鼠,计算各组的减虫率。结果各组的减虫率:单独rSj14-3-3组为27.6%,rSj14-3-3+PcDNA3.1(+)mIL-12组34.9%,rSj14-3-3+PcDNA3.1(+)mIL-12PLGA微球组37.5%,rSj14-3-3与rSjGST混合后+PcDNA3.1(+)mIL-12PLGA微球组38.8%;各组减卵率分别为(按以上组序)35.3%,49.1%,50.5%,和43.1%。结论PLGA微球给药系统可诱导并调节体液与细胞免疫从而增强了疫苗的抗感染,抗生殖作用。但rSj14-3-3和rSjGST抗原之间未表现出协同作用。mIL-12刺激机体产生CTL和辅助性T细胞(Th),在BALB/c鼠抗血吸虫攻击感染发挥作用,增强了疫苗保护作用。     

日本血吸虫中国株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白真核重组体的构建及其免疫小鼠的保护性研究

目的研究日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SjSDISP)全长编码基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫保护性效果。方法将全长SjSDISP基因克隆到真核表达载体pcDNA3上,构建真核表达质粒pcDNA3-SjSDISP,用重组裸DNA免疫昆明小鼠3次,间隙2W,末次免疫后第二周进行日本血吸虫尾蚴攻击感染,感染后42 d处死小鼠,剖杀冲虫,计算减虫率和减卵率。结果经双酶切、PCR和测序验证,表明真核表达质粒pcDNA3-SjSDISP构建成功。动物免疫保护性实验结果显示:pcDNA3-SjSDISP疫苗组减虫率较低,与对照组相比减虫效果不明显(P>0.05);但在每克肝卵、每克粪卵和每雌子宫内卵方面,与对照组相比差异均具有显著性(P<0.01)。结论日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白DNA疫苗可能主要在抗血吸虫卵胚发育或抗生殖起作用,具有潜在的疫苗研究与开发价值。     

Sjcb2 DNA疫苗在血吸虫感染小鼠中的保护性作用研究

目的 研究Sjcb2 DNA疫苗在日本血吸虫病小鼠模型中的保护性作用和机制,为血吸虫疫苗的研究提供有效的候选抗原分子。方法 构建pcDNA3.1(+)/Sjcb2 核酸疫苗,将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为pcDNA3.1(+)/Sjcb2 核酸疫苗组、pcDNA3.1(+)空质粒组及生理盐水组,每组35只,采用后腿股四头肌注射方法,每次免疫质粒DNA 100 μg,每2周免疫1次,共免疫3次,用日本血吸虫尾蚴攻击感染各组小鼠。PCR及免疫组化法检测Sjcb2基因在小鼠体内的稳定性及表达情况;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应;ELISA法检测小鼠血清中Sjcb2抗体水平及攻击感染前后脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平;计数小鼠荷成虫对数和肝脏荷虫卵数。结果 疫苗组小鼠均可在小鼠肌细胞中检测到Sjcb2基因及其抗原的表达;DNA疫苗组T细胞增殖显著增高(P <0.05);ELISA 结果显示疫苗组IFN-γ 水平显著增高(P <0.05),血吸虫尾蚴攻击感染后各组小鼠IL-4水平显著升高(P <0.05)。DNA疫苗组小鼠荷成虫对数及肝脏荷虫卵数与其它组比较显著性减少(P <0.05),其减虫率为36.32％,减卵率为60.61％。结论 Sjcb2 DNA疫苗接种小鼠后能在小鼠肌细胞中稳定存在和表达;Sjcb2可能通过提高IFN-γ 和降低IL-4水平调节Th1细胞亚群产生抗血吸虫感染的保护性作用。     

日本血吸虫Sj23DNA疫苗的增效研究

目的 探讨缺失肿瘤转移有关基因ME491同源序列的日本血吸虫Mr23 000膜蛋白基因（Sj23DNA）突变体疫苗的免疫效果。 方法 将Sj23DNA中与人黑素瘤细胞膜上的ME491同源序列进行基因缺失突变，再将突变基因转染真核细胞人胚肾HEK293细胞，通过间接荧光抗体试验（IFAT）检测其表达情况。将pcDNA3-Sj23突变体经股四头肌注射免疫小鼠（100 μg/只），免疫后4周取注射部位肌肉作冰冻切片，IFAT检测目的基因的表达。40只BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别经股四头肌注射pcDNA3-Sj23突变体、pcDNA3-Sj23、空白质粒pcDNA3（均100 μg/只）和生理盐水（30 μl/只）免疫1次。免疫后4周用尾蚴攻击感染（40±2条/只）。第42天剖杀，肠系膜静脉灌注法及挤压法计数成虫，取肝脏计算每克肝组织虫卵数（EPG）。以减虫率和减卵率评价其免疫保护力。 结果 pcDNA3-Sj23突变体疫苗可在真核细胞HEK293中瞬时表达。pcDNA3-Sj23突变体在小鼠注射部位骨骼肌细胞上出现较强荧光，空白对照组未见特异性荧光。pcDNA3-Sj23突变体获得40.3%减虫率和42.8%减卵率，pcDNA3-Sj23获得33.1%减虫率和28.9%减卵率。两组差异均有统计学意义（P值均<0.05）。 结论 与pcDNA3-Sj23相比，缺失ME491同源序列的cDNA3-Sj23突变体疫苗能诱导BALB/c小鼠产生更好的免疫保护效果。     

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的?摇探讨重组白细胞介素－4（IL-4）真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。 方法 将小鼠IL-4 基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒， 并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA (VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠，设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达，末次免疫3周后攻击感染，用减虫率及减卵率表示保护力。 结果 重组IL-4和组织蛋白酶B DNA均在小鼠肌细胞表达，重组IL-4和组织蛋白酶B DNA联合免疫小鼠，产生43.2% 的减虫率和76.6% 的减卵率，与组织蛋白酶B DNA单独免疫相比差异有显著性（P<0.01，P<0.05 ）。 结论 重组IL-4 能提高日本血吸虫组织蛋白酶B 核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用，具有佐剂的免疫效应。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究

目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用。方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定。获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数。结果RT-PCR扩增出大小为440bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光。重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率。结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫(大陆株)14-3-3 epsilon同型信号转导蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

目的：探索日本血吸虫新的疫苗候选分子对小鼠的保护性免疫效果。方法：利用已构建的真核表达质粒pBK-Sj14-3-3在大肠杆菌ＢＬ２１内表达的日本血吸虫（大陆株）14－3－3epsilon同型融合蛋白质，免疫6周龄BALB／c雌性小鼠，免疫3次，每次间隔2周，第3次免疫后2周感染尾蚴。42d后剖杀小鼠，计算其减虫率和肝减卵率。结果：各免疫组与对照组相比，均获得了部分抗血吸虫保护性免疫力，第1、2、3各免疫组的减虫率分别为32．7％（P＜0．05）、30．7％（P＜0．05）、27．5％（P＜0．05）；其肝减卵率分别是48．5％（P＜0．05）、43．1％（P＜0．05）、28．2％（P＜0．05）。结论：首次证明日本血吸虫14－3－3epsilon同型重组融合蛋白可诱导小鼠抗血吸虫感染的部分保护性免疫力。