应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA

成年雄性Ｗｉｔａｒ大鼠，用地高辛标记的ｃＲＮＡ探针在胰腺切片上进行原位杂交，以检测胰岛Ｂ细胞胰岛素基因表达产物ｍＲＮＡ；同时并用免疫组织化学法显示相邻切片胰岛素免疫反应阳性细胞，进行比较，胰腺经４％多聚甲醋灌注固定，经Ｂｏｕｉｎ液再固定２０ｈ，常石蜡包埋和切片，经胰岛素ｃＲＮＡ探针杂交的胰腺切片中胰岛Ｂ细胞和核仁呈阳性反应，阳性信号为蓝色颗粒，胰岛其他细胞及胰腺泡细胞为阴性，方法照切片中均无阳性信     

牛碘酸转运体的cDNA在大鼠脑内的分布

为了观察牛磺酸转运体的ｃＤＮＡ的大鼠脑内的分布，用＾３５Ｓ标记的ＴＡＵＴＤＮＡ探针，对大鼠全脑连续切片进行原位分子杂交，阳性反应广泛分布于脑灰质的不同区域，例如嗅球、梨状皮质，大脑皮质 、齿状回、海马和颗粒层细胞为阴性，而周围的胶质细胞为阳性，脑干的某些核，在灰质的神经元和社会胶质细胞观察到反应颗粒。     

使用Y染色体特异性探针追踪检测大鼠脑内移植细胞

目的探讨准确高效追踪检测脑内移植来源细胞的方法。方法克隆雄性大鼠Y染色体SRY基因的一个片段,并且将该片段标记成DNA探针,对大鼠的脑切片进行原位杂交。结果使用大鼠Y染色体SRY基因片段标记的探针后,可以特异性检测雌性大鼠脑内来源于雄性大鼠的移植细胞。结论使用原位杂交方法可以有效、准确地追踪检测移植细胞。     

MitoTracker对在体小鼠小脑和体外培养颗粒细胞线粒体的染色方法

目的:采用线粒体红色荧光探针MitoTracker标记小脑颗粒细胞线粒体,并与标记体外培养神经元线粒体进行比较,探讨MitoTracker标记在体脑细胞线粒体的实验方法。方法:在脑立体定位仪下,微量注射MitoTracker线粒体红色荧光探针到小鼠小脑皮质,继续饲养3 d后,常规取脑、固定、切片,利用共聚焦显微镜观察线粒体标记情况。结果:共聚焦显微镜下,可观察到在体标记的神经细胞内颗粒样线粒体呈团块状分布,排列较体外培养神经元标记的杆状线粒体紧密。结论:MitoTracker线粒体红色荧光探针可用于标记在体小脑细胞的线粒体。     

应用引物原位标记技术快速检测SOX2基因

目的 应用引物原位标记(primed in situ labeling,PRINS)代替荧光原位杂交技术对SOX2基因进行快速检测.方法 常规制备人外周血染色体并制片,利用SOX2基因特异性引物在染色体上原位扩增包含生物素标记的探针.用酪胺信号放大(tyramide signal amplification,TSA)生物素系统处理经标记的探针.最后用链霉亲和素-德克萨斯红(streptavidin-Texas red)对生物素信号进行荧光染色,用DAPI染料对染色体进行复染.作为对照,MCF-10F细胞用慢病毒载体转染导人SOX2基因,使用相同的方法检测结合位点.结果 VideoTesT-FISH软件分析提示,实验组3号染色体长臂端有特异红色荧光信号表达,空白组与未经TSA信号处理的对照组则无特异性的红色荧光信号.经过转染的MCF-10F细胞则表现出不同的SOX2基因整合效果.结论 PRINS技术利用高敏感度的原位PCR技术(in situ PCR)结合荧光标记的脱氧核苷酸可在细胞内原位合成形成探针,可大大减少探针的费用与检测的时间,提高检测效率.在诱导多能干细胞的鉴定与分类中具有较为广泛的应用前景.     

乙型肝炎病毒（HBV）相关性肾炎患者肾活检组织中HBVDNA分布…

为探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）相关性肾炎的发病机理，应用地高辛素标记ＨＢＶＤＮＡ探针原位分子杂交（ＩＳＨ）和直接原位聚合酶链反应（Ｓ－ＰＣＲ）技术，对２０例临床诊断为ＨＢＶ相关性肾炎患者肾活检石蜡包埋组织切片检查。在ＩＳＨ中采用ＨＢＶ ＤＮＡ两种探针；用全长段探针；８５％（１７／２０）ＨＢＶＤＮＡ阳性，这１７例阳肾组织切片再用ＨＢＶＤＮＡＳ加Ｃ段探针检测，１４例阳性（８２．３５％）。在ＩＳ－ＰＣＲ中     

大鼠脑组织中CNTF基因克隆及其探针制备

目的　克隆大鼠CNTF基因并制备地高辛标记的CNTF探针。方法　采用RT PCR法 ,从大鼠脑组织mRNA中扩增CNTF基因ORF区片段 ,克隆入T载体 ,并经序列测定。以地高辛素标记CNTF基因片段为探针 ,对成年大鼠脊髓组织切片进行原位杂交。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 6 16bp相符 ,序列测定与CNTF基因 10 0 %同源。原位杂交显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓白质的前索及侧索的周边部分 ,为杵棒形和三角形带有纤细突起的胶质细胞。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的CNTF基因克隆 ,地高辛标记的CNTF探针原位杂交显示正常大鼠脊髓白质的部分胶质细胞中表达CNTFmRNA。     

人胚胎甲状腺褪黑素受体的鉴定及生物学特性

目的 :应用免疫组化和核酸原位杂交技术检测人胚胎甲状腺的ＭＥＬ受体及其亚型 ,为进一步研究ＭＥＬ对甲状腺功能的调节作用提供证据。方法 :1 研究对象 :中期水囊引产人胎儿 ,取出甲状腺 ,立即用4%多聚甲醛 0 .1 %ＤＥＰＣ固定 ,石蜡包埋组织 ,4℃冰箱贮存待检测。 2 ＭＥＬ探针制备 :在ＬＢ培养基中分别培养含有ＭＥＬ1Ａ或ＭＥＬ1Ｂ受体质粒的大肠杆菌 ,离心 ,回收大肠杆菌。按照华舜公司质粒抽提纯化试剂盒说明抽提纯化质粒 ,质粒酶切 ,地高辛标记探针 (宝灵曼公司 ) ,测定标记效率 ,探针浓度均达到 80ｎｇ/μＬ。 3 核酸分子原位杂…     

用PCR制备地高辛精标记的单链探针进行原位杂交

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法制备地高精标记的单链探针，用以原位检测低丰度的β肾上腺素能受体ＭＲＮＡ在大鼠肺组织中扮布。结果表明本方法制备的探针的检测敏感性显著高于用随机引物法标记的双链探针。已克隆于载体的ＣＤＮＡ或ＲＴ－ＰＣＲ产物均可作为模板合成单链探针，江ＤＡＴＰ、ＤＣＴＰ、ＤＧＴＰ浓度各为２００μｍｏｌ／Ｌ，ｄＴＴＰ＋Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度降至５０－７５ μｍｏｌ／Ｌ，扩增产量无显著变化，ｄＴＴ     

锇酸固定组织的包埋后免疫电镜胶体金标记方法的改进

目的建立一种适用于中枢神经系统蛋白质抗原定位的包埋后免疫电镜胶体金标记方法。方法利用还原锇酸固定大鼠脑组织切片,首先在冰冻漂浮切片上用NaIO4确定待检抗原的可修复性,然后在亲水树脂Technovit7100包埋的半薄切片寻找使抗原得以最大程度修复的最佳NaIO4浓度,最后在超薄切片上进行相应抗原的免疫胶体金标记。结果NaIO4对不同抗原的修复作用明显不同。对于可修复抗原,低浓度NaIO4即可以使其充分修复。低浓度NaIO4处理组织可使组织超微结构保持完好,并可使胶体金高密度标记。     

间接法原位PCR在cHL IgH基因重排研究中的应用

目的：探索在石蜡切片上进行间接法原位PCR的可行性及利用产物探针检测IgH克隆性基因重排的意义。方法：选取获得IgH克隆性基因重排的经典型霍奇金淋巴瘤（cHL），纯化产物合成探针，进行间接法原位PCR。结果：在H/RS细胞和周围背景细胞核内均发现棕褐色杂交颗粒，利用产物探针互测时也能出现杂交颗粒。结论：在石蜡切片上进行间接法原位PCR是可行和有效的，但产物探针的精确性仍有待进一步证实。     

2型糖尿病大鼠糖脂代谢相关基因表达谱

目的研究伴胰岛素抵抗2型糖尿病大鼠与正常大鼠内脏脂肪组织基因表达的差异。方法Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠22只,实验组[小剂量链脲佐菌素(25mg/kg)加高脂饲料]12只,对照组(常规饲料)10只。从脂肪组织中抽取总RNA,纯化mRNA并逆转录为cDNA,Cy5标记实验组cDNA,Cy3标记对照组cDNA,获得两组动物来源的cDNA探针。cDNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。用逆转录-PCR对其中两条基因进行验证。结果丙酮酸脱氢酶磷酸酶同工酶2基因在2型糖尿病大鼠脂肪组织表达降低、磷酸化酶激酶催化亚单位基因表达增高;脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水合酶、脂酰CoA氧化酶、β-酮脂酰CoA硫解酶基因表达增高,脂蛋白脂肪酶基因表达降低。应用逆转录-PCR验证,脂蛋白脂肪酶基因在实验组表达降低(P<0.01),而β-酮脂酰硫解酶基因在实验组表达增高(P<0.01),与芯片结果一致。结论糖代谢限速酶影响胰岛素敏感性;脂解作用增加在2型糖尿病胰岛素抵抗和β细胞功能减退中起重要作用。     

同位素标记探针对检测肺组织氧合血红素酶表达的影响

由于同位素标记探针特异性强 ,灵敏度高 ,一直是基因表达实验研究中常用的标记物 ,我们在检测大鼠肢体缺血再灌后不同时点 ,肺组织氧合血红素酶 (ＨＯ - 1)的表达时 ,用 [α - 3 2 Ｐ]ｄＣＴＰ标记ＨＯ - 1探针 ,并于标记后进行探针纯化。现报道其效果与不纯化探针的比较。材　料　和　方　法1　随机引物标记试剂盒 (北京鼎国生物工程公司产品 )。2　模板ＤＮＡ取肢体缺血再灌后大鼠肺组织 10 0ｍｇ按常规方法提取ＤＮＡ。3　探针标记 ,反应体系用 2 5 μＬ无菌水溶解模板ＤＮＡ 2 5ｎｇ ,加 1 0 μＬ随机引物混匀 95℃ - 10 0℃ 2ｍｉｎ ,…     

三种固定液对Feulgen反应显示DNA的比较

<正>本实验用10%福尔马林(10%FA),FAA液(甲醛、95%酒精、冰醋酸按10:85:4体积比)及Carnoy氏液作为固定液,对一个月SD大鼠睾丸组织(约3mm~2/块)进行固定.制得5μm的切片后,分别用Felugen反应显示DNA和H—E染色法染切片,并对Feulgen染色切片中的糖原细胞用图象分析仪进行DNA定量测定.结果发现:(1)选择60个左右大小、染色深浅均相近的精原细胞进行图象分析,用平均光密度值进行比较.发现Carnoy固定的切片,其均值最大而变异系数(CV)最小;10%FAA固定的居中,FAA固定的切片均值最小而CV最大.在镜下观察中,发现10%FA及FAA液固定后的切片染色均匀而Carnoy所染切片中曲细精管着色深浅不一.所以我们认为,(1)用10%FA作固定液对DNA的定量分析较适合.(2)对细胞核及细胞质的形态而言,经FAA液和Carnoy氏液固定的组织,其染色效果较由10%FA固定的组织好.经 FAA液和Carnoy氏液固定的切片,低倍镜下可见曲精小管管腔内初级精母细胞的丝状染色体及其他细胞的颗粒状染色质,高倍镜下核的结构更加清晰.而经10%FA固定的组织切片,低倍镜下管腔内的各级生精细胞的胞核呈现均匀成片的紫红色,观察不到丝状染色体,高倍镜下仔细分辨,才可隐约见到.但因Carnoy氏液固定的组织块脆性大,不易切片,所以FAA液固定最适于形态观察.     

地高辛精标记RNA探针原位杂交的简便方法

用地高辛精标记ＴＨ基因合成ＲＮＡ探针，在冰冻组织切片上进行原位杂交，通过碱性磷酸酶催化的呈色反应，检测在基因治疗帕金森病大鼠动物模型研究中酪氨酸羟化酶基因在脑内的表达。实验结果表明，简化原位杂交方法可适应于任何实验室。     

小鼠Y染色体RNA探针的标记和应用

目的标记小鼠Y染色体RNA探针，检验该探针在检测外周血涂片和脑组织切片Y染色体阳性细胞的效率。方法以小鼠Y染色体重复序列pY353/B cDNA为模板标记RNA探针。以雌性小鼠为对照，用原位杂交法检测小鼠外周血涂片Y染色体阳性细胞；用荧光原位杂交法检测雄性小鼠脑组织切片Y染色体阳性细胞。结果Y染色体原位杂交法在外周血涂片Y染色体阳性的检测灵敏度和特异度均为100％，在脑切片检测Y染色体阳性细胞的灵敏度和特异度分别为85．67％和100％。结论小鼠Y染色体RNA探针的原位杂交和荧光原位杂交法检测Y染色体阳性细胞有较高的灵敏度和特异度。     

一种生物素标记探针DNA—RNA原位杂交方法

一种生物素标记探针ＤＮＡ—ＲＮＡ原位杂交方法王建明，李凌，沈贵华，崔惠云，李申德我们采用国产生物素光标记试剂盒标记探针，用于细胞涂片，冰冻切片及石蜡切片的原位杂交，检测细胞中目的基因的转录产生水平。一、材料和方法１．标本：人大肠肿瘤手术标本，冰冻切片...     

电镜水平的原位缺口翻译:一种研究细胞内DNA 酶Ⅰ敏感区的方法

缺口翻译法最常用于标记离体提纯的DNA,但亦可用于原位标记活性染色质区域。Levitt 等用对活性染色质敏感的 DNA 酶Ⅰ,选择性标记了分离细胞核中核酶敏感性序列。进而,此技术也被成功地用于未固定或固定的材料,光镜水平原位研究染色体和细胞内 DNA 酶Ⅰ敏感序列的定位。本文作者将原位缺口翻译技术应用于电镜水平。Ehrlich 瘤细胞用 Lowicryl     

生物素标记探针原位杂交法检测细胞滴片和组织切片中人乳头状瘤病毒

生物素标记探针原位杂交法检测细胞滴片和组织切片中人乳头状瘤病毒邢鲁奇，马钧，刘鸿瑞，司静懿使用国产生物素缺口平移法标记ＤＮＡ试剂盒对扩增、提取和纯化的人乳头状瘤病毒（ＮＰＶ）ＤＮＡ进行标记，制备ＨＰＶＤＮＡ探针，建立了原位杂交检测细胞滴片、冰冻切片和...     

神经系统中Isl-1基因的表达

同源框基因Isl-1是LIM基因家族的一员.在哺乳动物中Is-1基因表达的蛋白结合于胰岛素基因的启动子部位,调控胰岛素基因的转录.由于脂岛素及其受体也存在于神经系统中,因此观察了神经系统中Is1-1基因的表达. 设计适当引物,以鼠脑中提取的mRNA为模板,用PCR方法合成Isl-1 cDNA.用35S或地高辛标记探针,取成年大鼠CNS不同部位做原位杂交.结果表明,在皮层、海马、小脑、垂体、背根节和脊髓中可见阳性细胞,表明互IsI-1可能在中枢神经系统中有广泛的分布与作用。