不结球白菜BcCHC1基因与TuMV互作机理的初步研究

【目的】为了提高不结球白菜对TuMV的抗性,该研究初步探究了不结球白菜BcCHC1基因与TuMV的互作机制。【方法】从不接球白菜中鉴定clathrin网格蛋白重链CHC基因家族成员,并克隆了1个CHC1,对其进行亚细胞定位、从候选基因中利用双分子荧光互补检测筛选出CI与6K2,VIGS诱导BcCHC1沉默后植株枯死,BiFC试验验证BcCHC1与TuMV蛋白之间存在的互作关系。【结果】（1）成功克隆得到不结球白菜BcCHC1基因,其编码序列长度为5 124 bp,共编码1 708个氨基酸。（2）在TuMV侵染不结球白菜30 d后,通过实时荧光定量PCR结果显示,接种TuMV株系中BcCHC1的相对表达量显著下降。（3）亚细胞定位发现BcCHC1定位在烟草表皮细胞的细胞膜与细胞核。（4）BcCHC1基因沉默株系观察发现,在接种TuMV前,BcCHC1沉默植株就已经死亡。（5）通过BiFC实验验证分析,发现BcCHC1可以与CI、6K2互作,与CI互作的位置主要在细胞核,与6K2互作的位置主要在细胞膜上。【结论】研究推测BcCHC1与TuMV的CI和6K2相互作用,通过影响网格蛋白依赖性内吞途径以及病毒复制等方式调控TuMV侵染不结球白菜的过程,但BcCHC1具体如何调控TuMV侵染不结球白菜的作用机理还需进一步研究。     

不结球白菜种质资源形态性状多样性分析

分析了125份不结球白菜的形态多样性.结果表明,我国不结球白菜具有丰富的形态多样性,以江苏的平均多样指数最高,达0.972,性状中以叶柄长的变异系数最大,达59.77%.通过多变量的主成分分析,第一主成分和第二主成分代表了不结球白菜形态多样性的48.4%.通过系统聚类,把125份不结球白菜种质资源聚成6类,普通白菜不同程度地分别与塌菜、菜心、分蘖菜和薹菜聚在一起,说明普通白菜与其它种类间存在一定的亲缘关系.     

不结球白菜自交不亲和S单元型的鉴定研究

依据甘蓝SRK基因保守序列设计SRK特异引物并进行验证,通过PCR-RFLP法分析16份不结球白菜自交系材料的SRK基因的多态性,根据其差异鉴定不结球白菜S单元型及自交不亲和性.结果表明:16个不结球白菜自交系SRK基因共产生6种不同的带型,其中有1个是强自交不亲和系,4个是弱自交不亲和系,且与田间测定的亲和指数相符,说明利用SRK基因的多态性鉴定不结球白菜纯合自交系的自交不亲和性和S单元型是可行的.同时对部分材料的SRK基因的核苷酸序列进行分析验证,表明相同类型SRK基因序列一致性较高,且SRK基因存在明显的单核苷酸多态性,为进一步自交不亲和性的研究奠定了基础.     

不结球白菜新种质P70-203雄性不育细胞质类型的鉴定

本研究根据OguraCMS、PolimaCMS的不育性状相关的线粒体基因序列设计特异引物,对不结球白菜雄性不育系新种质P70-203及其保持系P60-27-1进行PCR分析.研究结果表明,Polima引物P3/P4,P5/P6在不育系与可育系中均无扩增条带;Ogura引物P1/P2在不育系中扩增出750 bp的特异片段,但可育系中无扩增条带.将扩增的特异条带回收并测序,将得到的测序结果在NCBI中进行Blastn同源性比较,结果与青花菜Ogura(登录号:EU604643)和萝卜Ogura(登录号:AB055438)细胞质雄性不育同源性均达到99%.从分子角度初步推测:该雄性不育系新种质P70-203具有Ogura细胞质.     

不结球白菜分子遗传图谱的构建及分析

以不结球白菜'常州乌塌菜'和'二青'杂交产生的181株F2代分离材料为作图群体,利用ISSR、RAPD、SSR、SRAP等分子标记来构建不结球白菜分子遗传连锁图谱.结果表明,构建的连锁图谱包含11个连锁群,由139个标记组成,其中包括4个ISSR标记、19个RAPD标记、22个SSR标记和94个SRAP标记.其中偏分离标记37个,占26.6%;每条连锁群上的标记数在4～33个之间,连锁群长度在61～164 cM的范围,覆盖基因组950 cM,总平均图距6.8 cM.     

四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定

用不同浓度秋水仙素处理子叶期不结球白菜生长点对其进行染色体倍性操作,根据形态解剖学、细胞学特征和流式细胞仪进行倍性鉴定.结果表明,浓度为0.2%的秋水仙素处理4次的效果最好,四倍体诱变率为8.42%.与二倍体相比,四倍体植株叶片、花器官、气孔等均表现巨大性;气孔密度和结实率降低;抽薹较晚.用流式细胞仪进行倍性鉴定,对照DNA相对含量为100,疑似株为200,表明是四倍体;疑似株有2个值与对照的比值约为1和2,表明是嵌合体(2x 4x).流式细胞仪鉴定结果与染色体计数法鉴定结果一致,表明流式细胞仪可以较准确地检测不结球白菜突变株倍性.     

30个不结球白菜品种的耐弱光性鉴定

用人工遮荫技术对不同来源的30个不结球白菜品种进行弱光处理,以干物质减少百分率、叶片厚度减少百分率和叶绿素a/b减少百分率3个指标作为评价标准,用系统聚类分析方法,将30个供试不结球白菜品种按其耐弱光性分为3类,即耐弱光性强、耐弱光性中等和不耐弱光品种。其中耐弱光性强的品种6个,占全部样品的20%;耐弱光性中等的品种15个,占50%;不耐弱光的品种9个,占30%。方差分析结果表明,3类品种间的耐弱光性指标差异极显著。其中,品种暑绿、正大抗热青3号、热优2号、抗热605、矮王、华王属于耐弱光品种。     

不结球白菜BcDF1.2基因克隆与诱导表达

利用RACE技术,获得了不结球白菜防卫素基因全长序列,命名为BcDF1.2(DDBJ登录号AB302891).序列分析发现,BcDF1.2全长532 bp包含1个长度为96 bp的内含子区域,该基因编码79个氨基酸残基组成的蛋白质,与其他植物的防卫素基因和抗真菌蛋白基因有较高的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同植物间具有高度保守性.基因组DNA杂交表明BcDF1.2属于较小的多基因家族.水杨酸和霜霉病原菌诱导后,该mRNA不仅在诱导的叶片中转录表达增加,而且在未诱导的系统叶片中表达增加.BcDF1.2在不结球白菜叶片中的转录表达特点表明可能参与对霜霉病的抗性反应.     

脯氨酸对不结球白菜（Brassica chinensis）镉积累的影响

采用溶液培养的方法,研究了过量Cd对不结球白菜（Brassica chinensis）幼苗内源脯氨酸含量的影响及外源脯氨酸在不结球白菜Cd积累中的作用。100μmol？L-1 Cd处理明显增加不结球白菜叶片脯氨酸（Pro）的含量,并且随着Cd胁迫时间的延长,其含量也显著上升。100μmol？L-1 Cd处理明显降低脯氨酸脱氢酶（PDH）活性,而增加δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的活性。1~5 mmol？L-1外源Pro处理显著降低不结球白菜幼苗地上部Cd含量,对根系Cd含量无显著影响,但外源Pro处理并不能缓解过量Cd对不结球白菜幼苗生物量的抑制作用。外源Pro处理下,不结球白菜叶片中Pro含量与其地上部干重呈显著的负相关关系。     

不结球白菜BcTuRsO基因的克隆及表达

从不结球白菜抗病品种短白梗中克隆到一个抗芜菁花叶病毒(TuMV)相关基因,命名为BcTuRsO(Gen-Bank登录号FJ600376).该基因核苷酸序列全长650 bp,编码194个氨基酸,与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性.基因组DNA杂交表明,BcTuRsO基因可能以单拷贝形式存在,其表达是组成型的.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuRsO基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

小白菜种质资源对小菜蛾的抗性评价

本文就小白菜种质资源对小菜蛾的抗性进行室内鉴定,结果表明268份材料的虫害指数分布在18.10～100.00之间,种质资源间抗虫性差异达到显著水平.聚类分析将268份种质资源分为6大类,与高抗、抗、中抗、中感、感、高感相对应,其中筛选出高抗和抗性材料分别为6和11份.对268份材料的主要形态性状与虫害指数和抗性级别的相关分析表明,小白菜种质资源叶面的皱缩度与抗虫性存在一定的相关性,认为从叶面平滑型的种质资源中筛选抗虫性材料的可能性更大.     

钙、水杨酸和壳聚糖复配处理对小白菜抗盐性的诱导

以小白菜(Brassica campestris ssp.chinensis L.)为对象,采用根际施用结合叶面喷洒的方法,研究CaCl2、壳聚糖(chitosan,CTS)和水杨酸(salicylic acid,SA)两两复配及三元复配对小白菜盐胁迫逆境的诱抗作用。结果表明:SA,CTS,CaCl2复配施用均能显著降低盐胁迫下小白菜的盐害指数,降低小白菜叶片的丙二醛(MDA)含量,增强过氧化物酶(POD)活性,提高叶绿素含量。各处理以CTS+CaCl2复配施用对小白菜的诱导抗盐效果最好,对小白菜生长的促进作用最显著。SA,CTS,CaCl2三元复配的效果不如二元复配效果好,复配后存在一定的拮抗作用。     

硝态氮对小白菜铬污染毒性的调控作用

通过盆栽和水培试验,探讨了硝态氮对小白菜铬污染毒性的调控作用。结果表明:外源Cr6 对小白菜铬吸收和积累具有明显的促进效应,抑制了小白菜对铁养分的吸收并降低了小白菜的硝酸还原酶活性;硝态氮可有效缓减Cr6 对小白菜吸收铁和硝酸还原酶活性的抑制作用,促进小白菜碳氮代谢和Vc的生物合成,并刺激小白菜生长。在相同铬污染条件下,土壤硝态氮的增加促进了外源Cr6 向有机态转化,且硝态氮有协同强化小白菜吸收Cr6 的效应。表明硝态氮在促进小白菜生长的同时,也促进了小白菜对Cr6 的吸收,提高了小白菜的铬累积水平。     

菜心溶菌酶的提纯及酶学性质

菜心（ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ．ｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ．ｕｔｉｌｉｓ）叶子高速捣碎后,滤液经酸碱处理,硫酸铵分步沉淀,凝胶柱层析等步骤分离纯化溶菌酶,酶比活力达３４１４．６Ｕ／ｍｇ,纯化倍数为１９７．４。菜心溶菌酶在较宽的温度或ｐＨ值范围均有活性,最适温度为６０℃,最适ｐＨ值为５．８,底物Ｋｍ值为８７μｇ／ｍＬ。该酶对热和酸碱的稳定性较高,巯基和酪氨酸残基不是该酶活性中心的必需基团。     

不结球白菜BcTuR1基因的克隆及表达

从不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)品种‘短白梗'中克隆到一个抗TuMV相关基因,命名为BcTuR1(GenBank登录号FJ600374).该基因核苷酸序列全长1 019 bp,编码162个氨基酸.BcTuR1基因与芥菜抗病毒基因相似性最高为96%,其它没有与该基因相似性高于50%的序列.基因组DNA杂交表明,BcTuR1可能属于一个较小的多基因家族.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuR1基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

Isolation and Molecular Characterization of RALF Like Gene BcRALF from Brassica campestris ssp.chinensis var.parachinensis

The rapid alkalinization factor (RALF) gene is a new found plant polypeptide signal molecule, wide spreading in higher plants. In this study BcRALF was cloned from Brassica campestris sspchinensis Makino varparachinensis based on BcMF14 (GenBank accession number EF523516) from Bcampestris ssp. chinensis var. communis cv. Aijiaohuang. The sequence of this gene was 273 bp (GU086228) and was identified as a rapid alkalization factor gene according to its high identity with Boleracea var botrytis BoRALF1 and Arabidopsis thaliana RALFL9. Protein characteristics and sequence structure were predicted, and moreover, many bioactive sites were found. The results showed that the characteristics of the BcRALF protein consistent with its category as a peptide signal molecule.     

正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究

利用正交试验设计,从Mg2+、dNTP、引物、甘油4种因素3个水平,对不结球白菜ISSR反应体系进行优化,确立了适合不结球白菜的ISSR反应体系:在20μL反应体系中,含1×PCRbuffer,1.5mmol·L-1MgCl2,200μmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1引物,1%甘油,30ng模板DNA,1UTaqDNA聚合酶.通过梯度PCR测验,确定了适宜的退火温度.     

不结球白菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

从不结球白菜CMS新种质中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆了一个α-微管基因的cDNA全长序列,命名为TUBA2(DDBJ登录号为AB445012)。序列分析结果表明,该基因全长1 709 bp,最大开放阅读框为1 353 bp,编码450个氨基酸序列,与已公布的α-微管基因有较高的同源性。系统进化树分析发现,该基因在不同植物间具有高度保守性。Southern杂交表明TUBA2属于不结球白菜多基因家族的一个单一克隆基因。实时定量RT-PCR检测表明,该基因在不育系中的表达量显著低于保持系,同时在不同组织和细胞减数分裂不同时期该基因的表达量也存在明显差异。     

青菜组织培养和转化系统的初步建立

青菜(Brassica campestris ssp. chinensisL.),属十字花科芸苔属,是我国长江流域及南方各省普遍栽培的重要绿叶蔬菜。目前迫切需要培育抗病,抗虫,抗逆和具有优良农艺性状的新品种。用常规育种和细胞工程方法在青菜品种选育方面取得了一定的进展,但是受到种质资源,杂交不亲和性以及耗时长的局限,而遗传工程可提供一个有较大潜力的方法。