人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。     

重组胶原蛋白制备及其应用研究进展

胶原蛋白由于其独特的理化性质和生物功能,在食品、化妆品、生物医学等领域的应用日益广泛。然而,从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险,限制了其许多潜在用途的开发。重组(类)胶原蛋白具有与天然胶原蛋白相似的性质和功能,近年来,国内外学者对重组(类)人胶原蛋白的表达进行了广泛的研究。本文综述了近年来重组(类)人胶原蛋白表达、分离纯化和应用方面的研究进展,为该重组蛋白的制备提供指导意义。      

人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物。随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达。Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50%。纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4 mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白。     

类人胶原蛋白表达的优化与纯化的研究

将pET22b-COL6A2重组质粒,转入表达宿主菌大肠杆菌中,通过摇瓶实验优化重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件。结果表明:50mL LB（Amp）培养基（pH7.0）,接种量为5%,培养至OD值为0.7时,添加1mmol/LIPTG,诱导表达8h时原蛋白的表达量最高,为21.2%,并以Sepharose 6 Fast Flow对其进行纯化,得到纯度为90%以上的重组胶原蛋白。      

豇豆血红蛋白Lb II在大肠杆菌中的重组表达条件优化、纯化与鉴定

豇豆根瘤中含有大量豆血红蛋白。该蛋白是良好的天然色素,可用于人造肉的着色,本文将携带豇豆血红蛋白Lb II基因的质粒pET-15b转化进入大肠杆菌BL21中表达,并对表达条件进行优化。通过查找NCBI数据库得到一条全长456 bp的豇豆血红蛋白Lb II的序列,以pET-15b作为表达载体,大肠杆菌BL21-CodonPlus （DE3）-R-IL作为重组工程菌进行表达,成功表达出豇豆血红蛋白Lb II,并使用镍柱层析对蛋白进行初步纯化,同时添加抗坏血酸为抗氧化剂。以IPTG浓度、温度、时间为自变量,Lb II表达量为因变量进行单因素实验。结果表明,在IPTG终浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为25 ℃,时间为14 h时,重组豆血红蛋白Lb II的表达量最高,经SDS-PAGE凝胶电泳和可见光光谱分析法鉴定为目的蛋白Lb II。经响应面试验优化后,表达量可以达到7.30 μg/mL。本研究为后续使用工程菌发酵生产豆血红蛋白奠定了基础。     

重组融合蛋白MBP-BSH 在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3) (pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。     

在大肠杆菌中融合表达重组羧肽酶抑制剂

利用PCR技术扩增得到编码土豆羧肽酶抑制剂（carboxypeptidase inhibitor from potato，CPI）活性多肽基因，克隆于表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pGCPI，测序后将重组质粒转化到受体菌Escherichia coli BL21中。重组菌经IPTG诱导表迭，超声波破菌后，通过谷胱甘肽sepheroseFF亲和层析柱一步纯化得到融合蛋白，纯度大于979，6。融合蛋白经凝血酶切割并分离除去谷胱甘肽-S-转移酶后得到纯度大于98％的重组CPI，ELISA鉴定产物具有免疫原性，体外检测表明其促进纤溶的生物功能与天然CPI无明显差异。     

表面活性肽在大肠杆菌中的异源表达

为构建新型表面活性肽的表达载体,并探讨其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化,将编码新型活性肽A₆K的重复DNA片段(A₆K)₁₅分别插入到4中不同的原核表达载体中,经酶切和测序验证后,转化到3种不同的表达宿主进行表达,通过改变异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)浓度、诱导温度和时间来优化表达条件。表达产物通过镍-次氮基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA)螯合层析进行纯化,通过(A₆K)₁₅上的6×His与抗体特异性结合进行Western blot分析,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定产物浓度,进行经济效益分析。构建了含有目的基因(A₆K)₁₅的重组表达质粒,筛选出最优载体pET-28a-SUMO-(A₆K)₁₅和最优宿主BL21(DE3)。当IP...     

鲢鱼鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽提纯及结构鉴定研究进展

为了利用鲢鱼鱼鳞生产胶原蛋白,采用生物酶解技术制备胶原蛋白抗氧化活性肽,可以提高水产品加工附加值且更好地保护环境。本文综述了鲢鱼鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽的不同制备方式(包括固相化学合成法、液相化学合成法、酶水解法、DNA重组法等)和分离纯化方法(包括超滤法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、反相高效液相色谱法等),并对其结构鉴定方式(包括质谱分析、连续流快原子轰击质谱、电喷雾离子化质谱、基质辅助激光解析等)做了阐述,以期为鲢鱼鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽的进一步开发利用提供理论依据。     

富脯氨酸胶原蛋白的重组表达及热稳定性研究

细菌胶原蛋白制备工艺简单、成本低,在食品、医药材料等领域有着广泛的应用前景,但细菌胶原蛋白的热稳定性低,限制了其应用.该文以截短的酿脓链球菌胶原蛋白Scl2序列为研究对象,通过嵌合富脯氨酸序列,构建了表达高热稳定性重组胶原蛋白的大肠杆菌基因工程菌,并对重组菌株的发酵条件进行优化.结果 表明,在诱导菌体浓度为OD600值...     

蓖麻毒素A链基因的克隆表达、纯化及其活性

为了实现蓖麻毒素A链基因(rta)的克隆表达,制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA),借助重组腺病毒介导表达的RTB进入细胞,发挥RTA的细胞毒作用,检测其活性。重组质粒pET32a-His-RTA能正确表达RTA融合蛋白,相对分子质量约47 000,每升细菌培养物回收约50 mg的纯化蛋白质,在有RTB表达的系列中,细胞死亡率明显上升,最高可达50%~60%。说明利用pET32a表达系统可以快速获得大量有高生物活性的可溶性RTA融合蛋白质。以腺病毒为载体表达RTB可以帮助RTA进入细胞,对细胞发挥毒性作用。     

三聚氰胺脱氨酶基因克隆表达及活性测定

从载体pUC57-MDA中获得经过大肠杆菌密码子偏好性优化的三聚氰胺脱氨酶编码基因,将该基因连接至表达载体6HisT-pRSET中,构建了重组表达质粒6HisT-pRSET-MDA,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌BL-MDA并进行诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析并测定酶活性。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达上清液在53 000处有明显的蛋白质条带,与理论相对分子质量的吻合,其脱氨酶活性达5.61 U。     

重组大肠杆菌耐热α - 淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组大肠杆菌耐热α- 淀粉酶分离纯化及其酶学性质进行研究,结果表明：该酶分子量约为90kD,最适温度为60～70℃,最适pH 值为6.6,酶学动力学常数Km 值为143.52mmol/L;酶活力在pH5.4～7.8 较为稳定;4℃保存2 周酶活力仅下降一半,35℃保温3d 有50% 以上的酶活力,70℃以上酶失活很快;Mn2+ 对酶催化作用有较大的促进,K+、Ca2+ 有微弱的促进作用,Mg2+ 对催化反应无影响,Cu2+ 的抑制作用最强,其他金属离子Co2+、Zn2+、Fe2+ 对酶催化作用有不同程度的抑制作用;有机离子对酶催化作用均是抑制作用,其中抑制作用最强的是SDS。     

植物甜蛋白monellin基因工程菌表达条件的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌株BMC33。经IPTG诱导,其所含有的甜蛋白基因可高效表达。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50 mL/250 mL三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓为0.9mmol/L,32℃诱导5 h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的44.8%。     

重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L.     

禽蛋黄过敏原Gal d 6的重组表达、纯化鉴定

目的:建立表达蛋黄Gal d 6 重组蛋白工程菌,并鉴定重组Gal d6蛋白免疫活性。方法:直接合成Gal d 6 DNA,与pET-28a构建重组质粒,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达;优化表达条件制备重组Gal d 6蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到纯品蛋白;纯化Gal d6蛋白经间接ELISA及western blot鉴定Gal d 6蛋白免疫活性。结果:经DNA测序、SDS-PAGE、禽蛋过敏血清鉴定表达Gal d 6蛋白具有免疫活性,经镍柱亲和层析获得单一条带。该工程菌最佳表达条件为37 ℃,0.5 mmol/L IPTG,2 h,收获量每升菌液可收获重组蛋白约9.1 mg。重组蛋白与禽蛋过敏血清具有良好反应性。结论:建立稳定表达具有免疫活性的Gal d 6蛋白的工程菌株。     

大肠杆菌中表达Cry1C基因及其重组表达产物的纯化及复性

通过PCR方法将苏云金芽孢杆菌Cry1C基因从原始质粒中克隆出来。由于Cry1C基因携带了大量大肠杆菌稀有密码子,因此用PCR方法对其前86个密码子进行修改,以提高其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量。Cry1C蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式大量表达,将包涵体用8mol/L尿素溶解并用His TrapTM FF凝胶柱纯化。所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性折叠,最终得到可溶并有生物活性(由三化螟活性实验验证)的蛋白。Cry1C蛋白纯度可达99.2%。     

重组牛乳铁蛋白素在大肠杆菌中的表达

将牛乳铁蛋素(lactoferricin B)基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21大肠杆菌表达系统,筛选表达温度和诱导剂IPTG的浓度,使其在原核表达系统中表达,将诱导表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳及抑茵活性检测,证明该表达产物是乳铁蛋白素.实验结果表明,Lactofcrricin B基因能够在原核表达系统中表达,表达量约占细菌总蛋白的21%,而且表达的蛋白质具有生物学活性.