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重组猪IgGⅡB类Fc受体蛋白的原核表达和抗体的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
根据GenBank中猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体cDNA(swFcγRⅡB)基因序列(FJ608551),利用Primer5.0软件设计合成了1对特异性引物,扩增swFcγRⅡB去掉胞内区和跨膜区的基因,PCR产物经KpnⅠ+EcoRⅠ双酶切后,将截短的swFcγRⅡB基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-swFcγRⅡB,在IPTG诱导下成功表达了分子质量约为40ku的融合蛋白swFcγRⅡB-His,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体的形式存在。原核表达蛋白经纯化免疫小鼠,制备鼠源swFcγRⅡB封闭抗体,ELISA检测抗体效价为1:5120,具有高度特异性。Western-blotting检测表明,制备的多克隆抗体可以与融合蛋白swFcγRⅡB-His特异性结合。 相似文献
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将牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)编码区cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游,构建了重组表达质粒pc3bo2R;以重组质粒转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验检测boFcγ2R在转染细胞表面的表达,通过G418抗性筛选和连续克隆化,在转染细胞表面稳定表达了boFcγ2R受体分子,转染细胞的玫瑰花环形成率达90%。最后获得稳定表达boFcγ2R受体分子的COS-7转染细胞系,为受体的功能研究提供了良好的技术平台。 相似文献
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猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列(NC015153.1),应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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利用RT-PCR方法扩增了猪ERK6基因编码区的序列,将扩增产物与pMD18-T载体连接,构建了重组质粒;重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;采用Northern杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同部位骨骼肌中分析了ERK6基因转录本的个数、大小及组织表达谱。结果显示,所克隆的猪ERK6基因片段长1 113 bp,含有1个1 104 bp的开放阅读框(ORF),该ORF编码367个氨基酸;该基因与已报道的人ERK6基因核苷酸序列相似性为90%;猪ERK6基因在肌肉组织中只有一个转录本,大小约1.5 kb。此基因在骨骼肌中的表达量最高,心、子宫次之,卵巢最低;而在脂肪、胃、肝、脾、肺、肾、十二指肠和胰腺中未见表达。结果表明,猪ERK6基因与已报道的小鼠和人ERK6基因一样,主要在骨骼中特异表达。 相似文献
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构建猪肌生成抑制素 (MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体 ,并对mRNA进行转录水平的检测 ,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后 ,用PCR扩增的 1.2kb目的片段与 pMD18 T载体连接 ,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶解的表达载体 pET2 8a(+ )质粒定向连接 ,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录 ,对mRNANorthern杂交进行转录水平的检测。结果 ,所得到的序列与所设计的序列完全一致 ,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选 ;目的片段定向插入 ,阅读框架正确 ;RT PCR成功地反转录得到约 1.2kb的目的DNA片段 ,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影 ,见到清晰的 1.2kb特异带 相似文献
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PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及ELISA检测方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
采用PCR扩增了猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株的ORF2 3'端基因,将其连接到pET32a(+)质粒上并转化DH5a细胞,重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21菌,用1 mmol/L IPTG诱导表达重组菌.经sDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因已在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子质量约为33 ku;表达产物经超声波处理后,用Ni-NTA柱纯化,复性,用此纯化产物包被酶标板,建立了ELISA诊断方法,经对临床516份血清样品进行检测,结果表明仔猪的血清阳性率为35.2%,育肥猪的血清阳性率为60.6%,种猪的血清阳性率为69.8%. 相似文献
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采用PCR从重组克隆载体pGEMTSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接,构建重组表达载体pPIC9kTSO18,转化大肠埃希氏菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9kTSO18,用SalⅠ线性化,并电转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株,以甲醇进行诱导表达,SDSPAGE和Westernblotting分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80%以上,诱导72h目的蛋白表达量为0.5mg/mL。 相似文献
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参考GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)血清2型荚膜多糖基因的序列分别设计了3对特异性引物,通过PCR分别扩增了CpsA、CpsB、CpsC 3个基因,获得长约1 137、429、1 146 bp的片段,将其分别克隆到pMD 18-T中,经酶切鉴定和序列分析获得了阳性克隆子;再将CpsA、CpsB、CpsC分别插入原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21,在IPTG诱导下获得高效表达,经Western-blotting检测证实,表达产物CpsC有生物学活性,CpsA、CpsB无活性;将3种表达产物等量混合,做10倍递进稀释后,与分离出的猪嗜中性粒细胞作用,37℃5、0 mL/L CO2培养箱中温育4 h后加入底物液,测定D492 nm值。结果表明,App荚膜多糖对猪嗜中性粒细胞无毒性作用。 相似文献
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将鹅细小病毒VP2基因克隆到原核表达载体 pPROEX HTb及真核转移载体pFASTBAC HTb中 ,重组真核转移载体在DH10BAC 中经转座作用 ,成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX HTb VP2和杆状病毒表达载体BAC VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析 ,确定为阳性重组子 相似文献
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以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。 相似文献
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猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。 相似文献
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猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测 总被引:1,自引:1,他引:1
利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白. 相似文献
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为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析,结果证明,克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97.4%,而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体 pPIC9K,构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K-Bm86。 相似文献
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猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达 总被引:2,自引:0,他引:2
采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100%;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。 相似文献
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为探讨层黏蛋白受体的生理功能及其在疾病发生、发展过程中的作用,以培养的SD大鼠大脑皮质神经元的总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了SD大鼠层黏蛋白受体基因.将其克隆到pMD18-T载体中,经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP真核表达栽体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-LR进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到293T细胞,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其表达情况.结果表明,真核表达载体plRES2-EGFP-LR构建成功并可以在293T细胞中表达.该表达载体可以作为研究层黏蛋白受体生理功能的重要工具. 相似文献
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将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T-M-N中亚克隆至pBV220原核表达载体上,成功构建了重组表达质粒pBVM-N。将pBVM-N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,重组菌经温度敏感诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白,与M基因表达产物一致;经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因未获表达。 相似文献