脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达。 结果：质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度。细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。 目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。 设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。 方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。 结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达☆○

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2.0~2.5 kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。 主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后，在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的

背景：体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。 目的：构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。 方法：构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。 结果与结论：构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

Rapsyn重组质粒转染小鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可能性,并观察Rapsyn蛋白在靶细胞中的表达。方法采用全骨髓贴壁培养法分离纯化C57BL/6小鼠的BMSCs,在体外进行扩增、传代。取第3代细胞,采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至BMSCs中,并置荧光显微镜下观察转染结果;采用Western blot法检测靶细胞中Rapsyn蛋白的表达。结果 BMSCs经转染后24h可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染pEGFP-N1/Rapsyn质粒的BMSCs可稳定表达Rapsyn蛋白。结论利用脂质体介导法可将Rapsyn基因转染至BMSCs中,并能稳定表达Rapsyn蛋白。     

骨髓间充质干细胞表达的hVEGF121/EGFP融合蛋白的提纯及功能鉴定**

目的：用hVEGF121/EGFP真核质粒转染骨髓间充质干细胞,提纯其表达的hVEGF121/EGFP融合蛋白,并体外检测其功能。 方法：用课题组前期工作构建的pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒提取质粒DNA。通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒DNA转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白表达。用Amicon超滤离心管纯化融合蛋白。 结果：荧光显微镜下观察到转染pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒的骨髓间充质干细胞,Westen blot证实转染骨髓间充质干细胞的培养液中存在hVEGF121/EGFP融合蛋白表达。MTT试验证实人脐静脉内皮细胞数量在hVEGF121/EGFP融合蛋白组明显多于对照组(P < 0.05)。Miles实验证实hVEGF121/EGFP融合蛋白增加血管壁的通透性。 结论：①携带hVEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,在骨髓间充质干细胞中获得表达。②骨髓间充质干细胞表达的hVEGF121/EGFP融合蛋白在体外具有野生型血管内皮细胞生长因子的功能。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景：目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。 目的：观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。 材料：健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。 方法：用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。 结果：原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均> 0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。 结论：重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。     

构建稳定表达血管内皮细胞生长因子 的人间充质干细胞

背景：血管内皮细胞生长因子可有效治疗缺血性心脏病,但其在体内难以保持持续的有效浓度。 目的：构建稳定表达血管内皮细胞生长因子的人骨髓间充质干细胞株,检测经基因转染后外源基因的表达。 设计、时间及地点：观察实验,于2006-03/2007-04在上海胸科医院完成。 材料：人骨髓间充质干细胞株、血管内皮细胞生长因子由上海市胸科医院胸部肿瘤研究所基础实验室提供。 方法：扩增血管内皮细胞生长因子片断,构建pcPGK- hVEGF 165真核表达质粒,利用脂质体介导转染人骨髓间充质干细胞,然后进行阳性细胞克隆筛选。 主要观察指标：以RT-PCR、PCR、Western Blot、 ELISA 方法检测在稳定转染了pcPGK-VEGF165-IRES-GFP的3株细胞和稳定转染pcPGK- IRES-GFP的3株细胞中,人血管内皮细胞生长因子165在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。 结果：扩增血管内皮细胞生长因子后,成功了构建质粒 pcPGK-hVEGF165,并利用脂质体顺利转染了人骨髓间充质干细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。RT-PCR、PCR检测结果显示,在稳定转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞中表达的血管内皮细胞生长因子165信使RNA明显高于对照及未转染的人骨髓间充质干细胞,Western Blot、ELISA检测结果显示,稳定转染血管内皮细胞生长因子人骨髓间充质干细胞及培养上清中的血管内皮细胞生长因子蛋白明显高于对照及未转染的人骨髓间充质干细胞。 结论：采用脂质体介导基因转移技术可将人血管内皮细胞生长因子165顺利转染人骨髓间充质干细胞中,并获得稳定表达血管内皮细胞生长因子165的细胞株。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

含GDNF基因真核载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建含GDNF基因真核表达载体,并分析其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法从SD大鼠脑中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增GDNF基因,测序鉴定后将GDNF基因克隆入p CDNA3.1中,构建真核表达载体p CDNA3.1-GDNF;原代培养大鼠间充质干细胞,以脂质体介导法将构建好的真核表达载体p CDNA3.1-GDNF转染至间充质干细胞;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测GDNF在间充质干细胞中的表达。结果扩增的大鼠GDNF基因序列与Gen Bbank的参考序列完全一致,GDNF基因已经正确克隆到真核表达载体p CDNA3.1中;转染骨髓间充质干细胞4 h后,GDNF的mRNA和蛋白能在细胞中正确表达。结论 p CDNA3.1-GDNF真核表达载体构建成功,并能在大鼠间充质干细胞中正确表达,这为下一步研究携带GDNF的骨髓间充质干细胞治疗癫痫奠定了实验基础。     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染SHG-44胶质瘤细胞的实验表达研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的重组表达质粒（recombinant plasmid vector）pCMVCD转染SHG-44胶质瘤细胞，建立胶质瘤嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；改良Eagle培养基（DMEM）培养SHG-44胶质瘤细胞；脂质体lipofectamine2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选重组子；免疫细胞化学检测表达情况。结果测序证实pCMVCD质粒含有CD基因；脂质体成功介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，获取了抗性细胞克隆（定名SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。结论脂质体介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞的方法简单、高效；成功建立了胶质瘤CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞：脂质体及电穿孔转染法的比较

背景：基因转染细胞有病毒及非病毒载体法，因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题，实验探讨脂质体及电穿孔转染法。 目的：比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况，建立基因工程细胞。 方法：①脂质体法：取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞，将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h，再加入胎牛血清的培养基，孵育48 h 后行免疫组织化学检测，即为瞬时表达。48 h后加入含G418培养基筛选。②电穿孔法：取骨髓间充质干细胞，胰酶消化，用无血清培养基重悬细胞，将细胞悬液加入电转化池中，加入质粒，将电转化池移至电极间放电转导。转染48 h后，检测目的基因瞬时表达。48 h后加入含G418培养基筛选。用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况。 结果与结论：免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因子瞬时表达率约为5.80%，电穿孔法约为24.29%。脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡；电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞，免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上，RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。结果表明，用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞，并用免疫组织化学和RT-PCR方法证实细胞体外表达目的基因。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景：为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记。 目的：采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行。 材料：4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。 方法：无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能。 结果：经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2 周后油红O染色示有大量脂质沉积。 结论：绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

胰腺十二指肠同源框蛋白1基因转染人骨髓间充质干细胞及向胰岛样细胞的分化

背景：随着人胰岛素基因及某些血糖调节酶基因的克隆,以及重组载体为基础的基因克隆技术的建立,使骨髓间充质干细胞更容易向胰岛素分泌细胞分化,且具有体外扩增明显而无致瘤性的优点。 目的：利用胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)基因转染人骨髓间充质干细胞,观察基因修饰向胰岛样细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-01/07在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源于糖尿病患者,由青岛大学医学院附属医院干细胞中心提供。 方法：利用反转录聚合酶链技术构建PDX-1基因的cDNA,酶切后插入经相同酶切处理的含绿色荧光蛋白的空白载体PEGFP-N1,构成重组质粒,再进行Bgl Ⅱ、HindⅢ双酶切筛选、鉴定并测序。Percoll法分离培养人骨髓间充质干细胞,当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代。转染前1 d加入无抗生素培养基,将第3代细胞按5×105接种于6孔培养板,适量重组载体及脂质体溶解后混合形成DNA-脂质体混合物,培养5 h后更换普通培养液。同时设立对照组,在6孔板中进行空白质粒转染。 主要观察指标：脂质体介导转染后,荧光显微镜观察细胞转染情况;免疫荧光染色检测PDX-1蛋白的表达;双硫腙染色鉴定细胞分化情况。 结果：通过测序、凝胶电泳、酶切等确定PDX-1基因已正确插入重组质粒。荧光显微镜下,成功转染的骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,质粒转染效率约70%。转染8 d的细胞PDX-1呈阳性表达,对照组细胞PDX-1呈阴性。转染后14 d可见半悬浮的胰岛样细胞团,双硫腙染色呈棕红色,而未转染的对照组细胞双硫腙染色不着色。 结论：PDX-1基因重组载体能够导入人骨髓间充质干细胞且稳定表达,并可以转化为胰岛样细胞。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达☆

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。 方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。 结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。 结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景：有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性。 目的：拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-白细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞。 设计、时间及地点：以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成。 材料：原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdIL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：以反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达。 结果：腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达。 结论：应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞。     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。 目的：验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。 设计、时间及地点：两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。 对象：6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。 方法：扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5 组：①未转染组：仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组：双无L-DMEM +pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组：双无L-DMEM+pcDNA3.1- SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。 主要观察指标：对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。 结果：MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P < 0 01)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。 结论：双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。     

神经导向因子Slit2修饰骨髓间充质干细胞的表达研究

目的基因修饰骨髓间充质干细胞,使其神经导向因子Slit2蛋白表达稳定增多,从而使骨髓间充质干细胞更好地促进脑缺血后血管生成,显著改善神经功能恢复。方法采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,P3代细胞进行流式细胞仪鉴定,通过激光共聚焦显微镜观察其Slit2蛋白分布情况。利用脂质体转染技术,将p Sec Tag B/h Slit2-C-myc重组质粒转入骨髓间充质干细胞,经过Zeocin稳定筛选后,通过RT-PCR及Western blot检测骨髓间充质干细胞中重组Slit2蛋白的表达情况。结果 (1)成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并通过流式细胞仪鉴定;(2)通过激光共聚焦显微镜发现Slit2蛋白在骨髓间充质干细胞的细胞膜及细胞质中均有表达;(3)成功将p Sec Tag B/h Slit2-C-myc重组质粒转染骨髓间充质干细胞;(4)RT-PCR及Western blot证实无论在基因水平或者蛋白水平,Slit2在转染后骨髓间充质干细胞中表达均增多。结论成功通过基因转染的方法实现骨髓间充质干细胞中重组Slit2蛋白表达量稳定增加,推动了进一步体内移植探讨其与血管生成机制的研究。