花生Rab2基因的克隆及表达分析

Rab2是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白从内质网到高尔基体的运输,研究发现有些Rab2基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得花生Rab2基因,本试验根据拼接的cDNA序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR克隆了1个花生Rab2基因。测序结果显示其cDNA含有长636 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含211个氨基酸,推测分子量为23.4 kDa。比对分析发现花生Rab2蛋白与多种生物的Rab2的氨基酸序列具有较高的同源性,荧光定量PCR研究表明AhRab2基因受低温、干旱、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控花生的抗逆性奠定了基础。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库,选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列,利用电子延伸和RT-PCR方法,获得一个开放阅读框为1 434 bp,编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸）,但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350）,因此,将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明,TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示,TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应,但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h,基因的表达量已达到对照的30倍,之后其表达量迅速回落,但仍高于对照;受ABA诱导时,其表达量略有增加,在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库，选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列，利用电子延伸和RT-PCR方法，获得一个开放阅读框为1 434 bp，编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸），但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350），因此，将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明，TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示，TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应，但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h，基因的表达量已达到对照的30倍，之后其表达量迅速回落，但仍高于对照；受ABA诱导时，其表达量略有增加，在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

小G蛋白Rab2基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

为了解叶锈菌侵染小麦后小G蛋白Rab2基因的表达情况,明确其与抗病性的关系,从分子水平上探讨小麦的抗叶锈病机制。以普通六倍体小麦近等基因系TcLr1和叶锈菌小种05-22-64①和05-8-63①为试验材料,构建小麦亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦小G蛋白Rab2基因的表达情况进行检测。结果表明:在小麦叶锈菌侵染过程中,Rab2基因主要在侵染的前期表达迅速,随着时间的推移表达量有所下降。非亲和叶锈菌菌株可以诱导小G蛋白Rab2基因表达量的升高,而亲和叶锈菌菌株抑制小G蛋白Rab2基因的表达。由此表明,小G蛋白可能与寄主和病原物的亲和程度有着直接的关系。     

小麦TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证

通过RT-PCR从小麦cDNA中扩增获得一个锌指蛋白基因TaCRF2, 该基因的cDNA长度为847 bp, 序列分析表明它编码一个含有280个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为30.97 kD, 等电点为7.03, 且在C-末端含有一个典型的RING-H2型锌指蛋白结构域, 在N-末端含有两个跨膜结构域。氨基酸序列比对发现, TaCRF2与水稻中的一个RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞核和细胞膜上。Real-time PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、盐和ABA的强烈诱导, 低温对该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐性。     

三角帆蚌Rab3 cDNA全长克隆及其原核表达

根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术获得三角帆蚌Rab3基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ190954）。序列全长1707 bp,开放阅读框666 bp,编码221个氨基酸,5’端非编码区为158 bp,3’端非编码区为883 bp。软件推测其编码蛋白相对分子量为24.92 KDa。NCBI Blastp进行氨基酸序列同源性分析表明,与居蟹皮海绵（Suberites domuncula）的Rab-3like（SdRab3）氨基酸相似性最高,为64%,构建进化树的结论也是先与居蟹皮海绵的Rab3-like（SdRab3）聚为一支。根据获得的Rab3基因cDNA全长序列,设计特异性引物扩增获得完整开放阅读框序列,并将已克隆到的三角帆蚌Rab3开放阅读框定向插入原核表达载体PQE-His质粒中,转化大肠杆菌BL21（DE3）。在30℃,5 h,1 mM IPTG的诱导条件下,Rab3蛋白得到高效表达,重组菌体经裂解和SDS-PAGE电泳分析,发现一条26 kDa左右特异的蛋白表达条带,其表达量约占菌体总蛋白30%。Western-blot检测表明,在健康组和病变三角帆蚌肝脏中,Rab3蛋白与β-actin的表达量比值分别为0.438和0.580。这一结果说明,Rab3基因在三角帆蚌经病原菌侵染后,表达量上调,且已有研究表明Rab3有通过调节中性粒细胞的胞吐作用来抵抗细菌侵入、防止机体感染的功能,从而初步推测三角帆蚌Rab3蛋白可能与三角帆蚌瘟病有关。     

干旱胁迫下不同抗旱性小麦BADH表达及甜菜碱含量的变化

根据已发表的几种植物的甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的AA同源保守区设计了1对简并引物,通过RT-PCR方法从小麦叶片中扩增出BADH cDNA的中间序列,共723 bp,编码240个氨基酸。Northern杂交表明,扬花期遭受轻度水分胁迫时,抗旱性较强（旱丰9703）与抗旱性较弱（山农215953）的2小麦品种叶片中BADH基因的表达没有明显差异;灌     

小麦TaMKK2基因的克隆及功能分析

小麦在生育周期内会遭遇多种非生物胁迫，制约小麦的生长发育。为了提升小麦新品种的抗逆性，本研究基于MAPK抗逆性基因开展实验，以冬小麦新品种‘新冬43号’为实验材料，采用同源克隆方法，获得了MKK2基因，暂命名为TaMKK2，对其编码的基因序列进行了生物信息学分析，并对该基因进行了亚细胞定位和原核表达分析。结果表明，该基因的cDNA序列全长为531 bp，含有1个完整的开放阅读框，编码176个氨基酸，相对分子量约20.07 kD，等电点为8.37；与山羊草、二穗短柄草MKK2基因的亲缘性较近；理论定位于细胞核上，然而实验操作未能检测到荧光信号；各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在，纯化复性后得到大小为20.07 kD的目的蛋白。本研究结果为小麦应对非生物胁迫以及利用基因育种技术改良植物抗逆性提供理论依据。     

棉花多胺氧化酶基因(GhPAO_2)的克隆及非生物胁迫下的表达分析

本研究以拟南芥多氨氧化酶(AtPAO2)为探针,在雷蒙德氏棉基因组数据库中获得同源基因并设计引物,利用RT-PCR技术克隆PAO基因,分离一个新的陆地棉PAO基因命名为GhPAO2。该基因cDNA全长为2 237 bp,具有一个1473 bp的开放阅读框,编码490个氨基酸残基,预测该基因蛋白质分子量为54.41 kD,等电点为5.69。利用Real-time PCR对该基因在不同组织和多种非生物胁迫处理进行表达分析,结果表明:GhPAO2基因主要在棉花花瓣和叶中表达;不同胁迫处理下GhPAO2基因表达量均发生显著变化,其中低温处理和20%PEG处理后基因表达量迅速上升并在1 h时表达量达到最高,200 mmol/L NaCl和1 mmol/L ABA处理则在24 h时表达量达到最高,表明GhPAO2基因受低温、PEG、Na Cl和ABA诱导表达,可能在棉花抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦小G蛋白Tarab5B基因全长cDNA克隆及表达特性的初步分析

通过对白粉病菌诱导的小麦叶片cDNA文库的测序,获得1个与水稻Rab5B基因一致性达89%的序列.以该序列为信息探针,筛选小麦EST数据库并进行电子拼接.根据拼接结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了1个小麦中尚未鉴定的全长cDNA克隆Tarab5B.Tarab5B基因编码的蛋白具有结合GTP/GDP的4个保守结构域以及Rab家族成员所特有的结构域.同源分析表明,该基因属于Rab5B亚族.麦类Rab5B蛋白的GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA和MGCSSS 5个结构域在进化上非常保守,而YYRGA结构域及其邻近的C端6个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低.RT-PCR检测显示,抗、感两个材料Tarab5B基因在接种后24 h和未接种24 h的表达水平基本相同;在接种后1 h、4 h、7 h、12 h,抗、感两个材料间Tarab5B基因的表达水平有一定差异.     

小麦幼苗水分胁迫应答基因表达谱分析

利用抑制差减杂交技术,分别构建小麦幼苗在水分胁迫1 h、6 h、12 h、24 h和48 h条件下的cDNA文库,得到6 733条EST序列。通过对这些序列的组装、比对、注释和分类,初步构建了小麦不同水分胁迫条件下的应答基因表达谱,发现水分胁迫应答基因表达的时间特性及4种表达模式。在648个已知功能注释的uni-gene中,6.17%属转录因子类基因,2.16%为蛋白磷酸酶类基因,4.01%是蛋白激酶类基因,19.90%为避免损伤和修复蛋白类基因,2.0%为大分子保护因子类基因,9.11%为膜蛋白类基因,这些基因可能是抗旱相关的重要基因。     

棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因GarTHA的克隆及功能验证

盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性, 是开展棉花耐盐性机制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫下差异表达片段序列信息, 经电子克隆技术和RT-PCR方法克隆了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因cDNA全长, 命名为GarTHA (GenBank登录号为KC167360)。该cDNA全长为1 018 bp, 包含一个822 bp的完整ORF, 编码273个氨基酸残基, 蛋白质分子量为82.57 kD, 等电点为4.89。GarTHA基因与杨树PtTHA基因同源性最高, 为84.6%。为进一步验证其功能, 利用拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体, 将GarTHA基因的完整ORF转入拟南芥中, 获得转基因植株并进行了耐盐性鉴定。结果表明, 在盐胁迫下转基因拟南芥种子的发芽率明显高于野生型, 且转基因植株的根长显著高于野生型。说明GarTHA基因可能参与植物的盐胁迫反应, 从而提高植物抗逆性。     

玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)活性与耐旱性的关系

在先期研究的基础上, 结合运用电子克隆和反转录PCR技术克隆玉米PP2C基因的全长cDNA序列, 再分别应用实时荧光定量PCR和非放射性标记法, 测定干旱胁迫条件下耐旱性不同的自交系PP2C基因的mRNA表达差异和酶活性差异, 以探讨PP2C酶活性与玉米耐旱性的关系。结果表明, 我们克隆的全长cDNA序列为玉米PP2C基因家族的新成员, 开放阅读框长1 164 bp, 编码388个氨基酸残基。将这一基因命名为ZmPP2Ca, GenBank注册号为EF195257。在干旱胁迫条件下, 该基因在耐旱自交系中下调表达, 使PP2C酶活性降低; 在不耐旱自交系中上调表达, 使PP2C酶活性升高。ZmPP2Ca基因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异, 可能与干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关。     

马铃薯SoFtsH基因全长cDNA克隆与在干旱条件下表达研究

FtsH (Filamentation Temperature-Sensitive H)是一种ATP和Zn²⁺依赖型金属蛋白酶,广泛存在于原核生物和真核生物中,在真核生物中是多基因家族。FtsH具有ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性,参与多种胁迫反应。从抗旱马铃薯（Solanum tuberosum）二倍体品系H145中分离得到cDNA-AFLP差异片段,利用RACE技术克隆了SoFtsH cDNA全长序列, 并对其进行分析。结果表明, 该序列包含完整的开放阅读框,长为723 bp, 编码129个氨基酸。SoFtsH具有2个铁氧化还原蛋白结合位点,并存在信号肽序列、跨膜区域和Zn²⁺结合域。SoFtsH基因序列与GenBank数据库中的其他FtsH基因进行同源序列比对, 并构建系统进化树, 发现该基因与番茄、烟草、拟南芥等高等植物FtsH基因同源性达90%以上。半定量RT-PCR和Northern Blot杂交结果表明SoFtsH基因在干旱胁迫下叶片和根系里的表达量明显增加, 且在抗旱品系H145与干旱敏感品系H214中表达模式不同。说明SoFtsH基因在马铃薯抗旱中起作用。     

白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用,利用这些基因改良作物抗逆性具有重要意义。本研究在白菜中分离到一个DREB类转录因子基因BpDREB1 (EF219470)。该基因序列全长647 bp,推测编码蛋白含213个氨基酸,相对分子量为23 kD,理论等电点为5.11,与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明,BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示,BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后,其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子基因具有家族成员基因结构的特征,在低温、干旱应答途径中起重要作用。