脱细胞尿道及其海绵体基质制备的实验研究

目的 探索脱细胞尿道及其海绵体基质的制备方法。方法取健康壮年兔完整尿道及其海绵体组织，以Triton-X100与NH3H2O联合提取法进行脱细胞处理。标本做HE染色，组织学观察分析脱细胞效果。结果脱细胞处理11天后，成功获得脱细胞及其海绵体基质，所得基质外观良好。HE染色观察无细胞存在。弹力纤维排列规整，间隙较大，结构无破坏。结论利用Triton-X100与NH3H2O联合提取法可成功制备完整无细胞尿道及其海绵体基质，为尿道再造修复提供崭新思路。     

一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法

目的探索一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法。方法取健康壮年兔完整阴茎海绵体组织，以Triton-X100与NH3·H2O（氨水）联合提取法进行脱细胞处理。标本作HE染色，组织学观察分析脱细胞效果。结果脱细胞处理25天后，成功获得脱细胞海绵体基质。所得基质外观良好。HE染色观察无细胞存在，弹力纤维排列规整，间隙较大，结构无破坏。结论利用Triton-X100与NH3·H2O联合提取法可成功制备完整无细胞阴茎海绵体基质。     

尿道细胞外基质的研制

目的 探讨尿道细胞外基质(ECM)的制备方法。方法 采用4因素3水平，9次实验的正交设计[L9(3^4)]。切取37只兔的尿道，27条按正交设计随机分为9组行尿道脱细胞处理，试验重复3次。采用HE染色及计算机图像分析对尿道基质进行残余细胞成分计数，统计分析获得最佳方法：0．4％胰蛋白酶、l％甲醛加0．2％戊二醛、40U／ml DNA酶(A3B2C3方案)。另l0条兔尿道制备成尿道ECM并用于同种异体尿道缺损修复实验；分别于修复术后l0d，3、6及24周取材观察缺损修复处组织再生情况。结果 各组脱细胞后残余细胞成分量均不相同，第7、9组未发现细胞残余成分；制备的尿道ECM经扫描电镜分析未发观细胞残片。缺损修复实验术后10d，基质中见单层上皮细胞，且有血管长入ECM中，但管径较小，基质和受体尿道连接处有炎性细胞浸润；3周时尿道ECM管腔已完全被上皮细胞覆盖；6周时可见平滑肌细胞再生，炎性细胞消失。24周后基本结构近似正常。结论 制备尿道细胞外基质中3个关键条件的最佳水平为A3B2C3，即在尿道脱细胞处理过程中采用0．4％胰蛋白酶、1％甲醛加0．2％戊二醛、40U／ml DNA酶。     

人脐动脉平滑肌细胞复合脱细胞基质构建海绵体平滑肌的动物实验研究

目的 探讨脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)与阴茎海绵体脱细胞基质(ACCM)复合构建海绵体平滑肌的可行性.方法 以1%的Triton-X100与0.1%NH3H2O混合液对兔阴茎海绵体进行脱细胞处理,制备ACCM.采用贴块法分离、培养、扩增HUASMC.HUASMC以30×10<'6>/ml密度接种ACCM,细胞-ACCM体外复合10 d后将复合物植入9只5周龄BALB/C裸鼠背部皮下,术后10、20和40 d分别对移植物进行HE染色、免疫组织化学染色和器官浴槽实验,评价其裸鼠体内构建情况.结果 ACCM为白色圆柱状,镜下为富含胶原的疏松多孔结构,不含细胞成分.HUA-SMC与ACCM相容性良好,HUASMC在与ACCM接触部位充分伸展,并沿ACCM窦隙活跃生长.9只裸鼠均存活,植入部位无感染,无植入物排斥发生.随培育时间延长,裸鼠体内ACCM逐渐降解,植入的HUASMC分化形成结构良好、交错排列的平滑肌组织.器官浴槽实验显示,构建组织对去氧肾上腺素和电刺激均表现出收缩功能,去氧肾上腺素和电刺激所诱导的最大收缩力分别为(3.64±0.18)和(2.50±0.21)g.结论 HUASMC作为种子细胞与ACCM复合可构建出具有一定形态和功能的组织工程海绵体平滑肌.     

尿道细胞外基质在兔尿道重建中的应用

目的 评价尿道细胞外基质作为一种生物材料重建尿道的效果. 方法 切取新西兰兔的尿道制备尿道细胞外基质.手术切除实验组1～1.5 cm的尿道片段后用细胞外基质修复缺损,采用ELISA法检测术前、术后12、24及48 h血清TNFα的水平,评估术后兔的免疫反应状态.术后10d和3、6、24周取修复段尿道,行组织学观察并做尿道造影、尿道镜及尿流动力学检查. 结果 术后实验组血清TNFα水平较对照组略有升高,但无统计学意义(P>0.05).术后10 d,上皮细胞开始从边缘向细胞外基质移行并出现新生小血管;3周上皮细胞覆盖细胞外基质的整个管腔;6周出现排列不规则的平滑肌纤维;24周平滑肌数量明显增多,成束状排列.尿道造影、尿道镜及尿流动力学检测检查显示,尿道基质管壁光滑,排尿通畅. 结论 尿道细胞外基质是一种安全有效的尿道重建材料.     

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价北大核心CSCD

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。     

应用组织工程口腔黏膜重建尿道的初步实验研究

目的 探讨兔口腔黏膜细胞的体外培养方法,并以其为种子细胞与异体膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft,BAMG)复合,构建组织工程尿道. 方法 18只10周龄雄性新西兰大耳白兔,体重0.3～0.5 kg.取其中12只兔口腔黏膜组织,分离获得口腔黏膜细胞.将口腔黏膜细胞分别接种于有3T3细胞及无3T3细胞的培养皿进行培养,接种后第2天于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制细胞生长曲线,观察生长增殖情况,并行免疫荧光组织化学染色鉴定.取余6只兔膀胱,经脱细胞处理制备BAMG,随机取1 cm×1 cm组织行HE染色,观察脱细胞效果.将接种于有3T3细胞培养皿培养获得的第2代口腔黏膜细胞种植于BAMG上,培养1周后,行HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合状况. 结果 倒置相差显微镜下观察,接种于有3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞可传至7～8代,其细胞形态均一,功能良好;无3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞形态多样,传至第2代时,即开始出现老化.细胞生长曲线显示,两种方法培养的口腔黏膜细胞均于第8天开始呈对数增长,第14天达峰值.接种于有3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞,培养至融合时所获得细胞数量明显多于接种于无3T3细胞培养皿的u腔黏膜细胞.两种方法培养的口腔黏膜细胞行免疫荧光染色,均呈绿色荧光.HE染色观察,BAMG经脱细胞处理后未见细胞,脱细胞效果良好.复合培养1周后,HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG复合良好. 结论 兔口腔黏膜细胞可在体外成功培养、扩增,与同种异体BAMG复合后生长良好,为构建组织工程尿道提供了一种新的选择.     

脱细胞肝素处理犬颈动脉的异种移植研究

目的：研究用去污剂-酶消化联合肝素结合处理法制备小口径异种移植血管.方法：犬颈动脉管壁经脱细胞后部分再行肝素结合处理,样本经组织学及电镜观察脱细胞效果,机械性能研究观察脱细胞对管壁弹性和强度的影响,甲苯胺蓝染色观察肝素结合效果和结合程度.将结合与未结合肝素的脱细胞血管同时植入16只兔双侧颈动脉,术后21 d B超观察移植血管的通畅情况.结果：犬颈动脉血管壁细胞被完全去除,细胞外基质保存完好,机械性能无明显破坏,肝素结合于管壁全层,植入兔颈动脉后两侧均无血管阻塞,而肝素结合组血栓形成少于未结合组.结论：去污剂-酶消化法联合肝素结合处理可以作为制备脱细胞小口径异种移植血管的新方法.     

脐带Wharton胶干细胞外基质的制备及其细胞相容性观察

[目的]建立制备脐带Wharton胶干细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的方法并对其生物相容性进行观察。[方法]无菌条件下收集人脐带组织,采用酶消化法分离培养脐带干细胞,使用普通培养基培养7 d后,在原培养基中添加抗坏血酸,再连续培养8 d;加入含有0.5%Triton X-100和20 mM NH 4OH的PBS溶液进行脱细胞处理后,用Hoechst 33258染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过天狼星红、甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白免疫荧光染色观察微载体的主要成分;将异体脐带干细胞种植在无细胞核DNA残留的ECM上,通过MTT法观察脐带干细胞的增殖生长情况。[结果]通过本实验方法得到的天然脱细胞脐带干细胞ECM,表面无细胞及DNA残留,整体表面有细胞陷窝形成,基质紧密连接。Hoechst 33258荧光染色阴性;天狼星红、甲苯胺蓝和番红花O组织学染色阳性;I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫荧光染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,种植于该ECM上的异体脐带干细胞组的OD值高于单纯平面培养组(P<0.05)。[结论]此次实验所得的脱细胞脐带干细胞外基质具有良好的生物相容性,能够为组织工程提供高质量的种子细胞,有望成为组织工程种子细胞的新型培养载体。     

羊颈动脉脱细胞血管基质的制备及其生物相容性评价

目的研究脱细胞血管基质快速高效的制备方法并对其进行生物相容性评价,为组织工程血管的研究寻找合适的支架材料。方法取20根长50mm新鲜山羊颈动脉经-80℃冷冻、37℃水浴复温,反复冻融3次,在506MPa、4℃条件下超高压处理20min,0.125%SDS中37℃振摇(100r/min)12h,彻底去除细胞后,行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察及生物力学测定研究其组织结构的变化;Hoechst33258荧光染色和细胞DNA残留量分析评价脱细胞效果;通过接触细胞毒性实验、MTT活性测试及皮下埋植实验对制备的脱细胞血管基质进行生物相容性分析。皮下埋植实验取清洁级SD大鼠10只,体重200～230g,分为2组(n=5),实验组于大鼠背部皮下埋植结合物理化学方法处理的脱细胞血管基质,对照组埋植单纯物理方法处理的脱细胞血管基质,分别于术后1、2、3、4、8周取出行HE染色观察。结果 HE染色及Masson染色显示脱细胞血管基质无细胞成分残留,保持较完整的胶原成分;扫描电镜观察血管表面以胶原为主,适合细胞黏附;Hoechst33258荧光染色脱细胞血管基质材料未见明显阳性核染色;苯酚-氯仿提取脱细胞血管基质残留DNA含量,电泳检测分析显示其中DNA含量较正常血管显著降低;生物力学检测示脱细胞血管基质最大荷载时的应力及应变与正常血管比较差异无统计学意义,保持了正常血管的力学特征;接触细胞毒性实验与MTT法测定示脱细胞血管基质与细胞有良好的黏附性,细胞毒性为0～1级;实验组皮下埋植术后8周材料周围基本未见炎性细胞,对照组仍有明显淋巴细胞浸润。结论经反复冻融、超高压及小剂量SDS处理的脱细胞血管基质是一种构建组织工程血管的理想支架材料。