脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Mller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Mller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Mller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Mller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜M-ller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜M-ller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜M-ller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜M-ller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染M-ller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mueller细胞的比较

目的：探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染体外培养的视网膜Mueller细胞的可行性和区别。方法：体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mueller细胞,免疫荧光染色法鉴定95％以上为视网膜Mueller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP—N1转染视网膜Mueller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果：荧光显微镜下检测转染后id,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP—N1转染Mueller细胞效率约为31．0％±2．8％,较脂质体法转染效率（10．5％±2．4％）更高。两者比较有统计学意义（P〈0．01）。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP—N1可在视网膜Mueller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论：脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mueller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜M&#252;ller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜M&#252;ller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜M&#252;ller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染M&#252;ller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对M&#252;ller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜M&#252;ller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染M&#252;ller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7&#177;1.9）%、（18.1&#177;16）%、（17.2&#177;2.5）%、（16.9&#177;1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2&#177;5.6）%、（96.1&#177;6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导M&#252;ller细胞的转染,为进一步明确M&#252;ller细胞的病理、生理功能及靶向M&#252;ller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

氮酮促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞及毒性的实验研究

目的探讨氮酮(AZONE)促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞的作用及其对细胞活性的影响。方法采用细胞培养方法,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因,配制不同转染液,脂质体联合pEGFP-N1、氮酮联合脂质体及pEGFP-N1、氮酮联合pEGFP-N1、单纯pEGFP-N1、单纯脂质体、单纯氮酮,分别处理兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。用RT-PCR方法检测EGFPmRNA表达情况。采用MTT法研究不同转染液对细胞活性的影响。结果单纯氮酮、单纯脂质体及对照组处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。氮酮联合脂质体及pEGFP2N1对兔角膜内皮细胞的转染效率为42.6%,脂质体联合pEGFP2N1组的转染效率为22.4%,氮酮联合PEGFP-N1组的转染效率为7.2%,单组质粒组的转染效率为1%。氮酮加脂质体加PEGFP-N1组转染效率高于其他转染组(P<0.01)。各组转染液对角膜内皮细胞活性无影响。结论氮酮可促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞,在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性,有望成为促进角膜内皮细胞基因转染的新型试剂。     

三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究

目的：以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flu—oreacent protein，EGFP)为报告基因，研究lipofectamine2000、Fu—GENF6和逆转录病毒载体介导的基因导入系统对视网膜色素上皮细胞的基因转染效率，为视网膜及视网膜相关疾病的基因治疗奠定基础。方法：在体外分离培养人视网膜色素上皮细胞，构建含有EGFP基因的表达载体，分别应用阳离子脂质体lipofectamine2000、FuGENE6和逆转录病毒三种方法将EGFP基因转染到人视网膜色素上皮细胞中，转染后于48h在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。结果：三种方法介导EGFP基因在人视网膜色素上皮细胞中表达的阳性比例平均分别为52％、10％和72％。结论：在体外可通过逆转录病毒系统或阳离子脂质体lipofectamine2000有效地将外源基因导入到人视网膜色素上皮细胞中，其中以逆转录病毒系统转染效率为最高。     

增强型绿色荧光蛋白基因在人胚胎视网膜前体细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染人胚胎视网膜前体细胞的转染效率及瞬时表达情况,建立人胚胎视网膜前体细胞的示踪方法,为视网膜前体细胞移植提供示踪依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过磷酸钙介导法转染人胚胎视网膜前体细胞．应用流式细胞仪检测其转染效率,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况。结果:pEGFP-N1在基因转染24 h细胞转染率为28．98％,48 h为32．45％,72 h为30．40％,对照未转染细胞24 h、48 h分别为2．50％和2．04％:体外观察培养细胞转染24 h已有绿荧光表达,48-72 h细胞荧光强度最强,96 h荧光强度减弱。结论:pEGFP-N1质粒能有效转染人胚胎视网膜前体细胞,其转染效率可达到30％,是人胚胎视网膜前体细胞较为理想的瞬时表达载体和细胞示踪报告分子。     

脂质体介导转染神经干细胞行糖尿病大鼠视网膜下移植的研究

目的观察大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)阳离子脂质体法转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的效果;研究阳离子脂质体Lipofectamine介导转染对大鼠胚胎NSCs糖尿病大鼠视网膜下移植的影响。方法将报告基因pEGFP-N1经Lipofectamine介导转染NSCs(EGFP组),观察EGFP的表达;以同期培养未转染的细胞作为对照组,测定细胞活力、生长曲线和转染效率。将两组NSCs分别行糖尿病大鼠视网膜下移植,RT-PCR、Westernblot分别检测TOLL受体4(TLR4)、NF-κB的mRNA及蛋白质表达。结果被转染的体外培养大鼠胚胎NSCs长期表达EGFP,两组细胞具有相似的形态学变化和生长曲线,流式细胞仪结果显示转染率最高可达35.2%。行视网膜下移植后,TLR4、NF-κBmRNA及蛋白质的表达差异无统计学意义。结论阳离子脂质体Lipofectamine介导转染NSCs效率较高,报告基因表达时间长,不影响糖尿病大鼠NSCs视网膜下移植。     

抗凋亡基因bcl-XL转染视网膜感光细胞的研究

目的 :探讨介导抗凋亡基因bcl-XL 转染视网膜感光细胞的有效方法。方法 :采用视网膜神经胶质细胞条件培养液体外培养的视网膜感光细胞 ;用脂质体LIPOFECTAMINETM2 0 0 0介导 pEGFP -C3 -bcl-XL 转染至感光细胞 ;采用滴度为 6 5× 10 12 pfu/L的重组腺病毒rAd -gfp -bcl-XL 转染感光细胞 ;在荧光显微镜下观察感光细胞中的绿色荧光蛋白表达情况来比较脂质体、重组腺病毒转染法的转染率 ;用免疫组化比较这两种方法转染的细胞中Bcl-XL蛋白水平。结果 :脂质体、重组腺病毒转染法的转染率分别为 0 1%、 60 % ,免疫组化示重组腺病毒转染的细胞的Bcl -XL 蛋白水平较脂质体转染的细胞高。结论 :在视网膜感光细胞的基因转染中 ,腺病毒介导的目的基因bcl-XL 的转染率及表达明显高过脂质体法 ,重组腺病毒介导的基因转染法是视网膜变性性疾病基因治疗的一种较理想方法。     

PEDF-GFP基因转染大鼠视网膜的实验研究

目的将重组表达质粒色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白(pigment epitheliumderived growthfactor-greenfluorescent protein,PEDF-GFP)以脂质体介导转染BN大鼠视网膜组织,观察其表达及定位。方法以脂质体介导的方法将重组表达质粒PEDF-GFP注射到BN大鼠视网膜下,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT-PCR方法检测PEDF表达情况。结果在荧光显微镜下观察GFP表达情况,第1d即可见明显的绿色荧光分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周。RT-PCR方法结果类似,转染后第1d即有PEDF mRNA表达,第1、2周表达明显增强,到第4周治疗眼的视网膜组织中PEDF mR-NA仍有较高水平的表达。结论阳离子脂质体可有效将PEDF-GFP基因转染视网膜组织、RPE细胞并得到持续表达,可望用于视网膜、脉络膜疾病的基因治疗。     

脂质体介导外源基因体外转染兔角膜内皮细胞条件的优化

目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000是否能介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞,并优化转染条件。方法:体外培养兔眼角膜内皮细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,通过体外细胞转染实验,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件,荧光显微镜观察目的基因的表达。结果:角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,LipofectamineTM在细胞融合度为80%~90%,脂质体/DNA为3L/g,脂质体的量为1.8μL,转染时间为5h时,转染效率最高。结论:阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内,GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件。     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响

目的 观察高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4(ATF4)的影响.方法 组织块悬浮法体外原代培养Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞,用链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法对Müller细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)的鉴定.将培养的视网膜Müller细胞分为正常对照组和A、B、C组,正常对照组使用5.5 mmol/L葡萄糖培养液,A、B、C组分别使用20.0、30.0、40.0 mmol/L葡萄糖培养液进行.培养4d后,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组视网膜Müller细胞上ATF4蛋白的表达.结果 体外培养的细胞均为视网膜Müller细胞,95％以上细胞染色呈GFAP及GS阳性.A、B、C组视网膜95％的Müller细胞呈阳性.Western blot检测显示,4d后A、B、C组Müller细胞表达ATF4蛋白的量均较正常对照组升高,组间比较,差异有统计学意义(q＝0.293、0.754、0.484,P＜0.05).结论 高糖能促使体外培养下的视网膜Müller细胞表达内质网应激蛋白ATF4增加,高糖培养下的视网膜Müller细胞可发生内质网应激反应.     

脂质体介导质粒DNA转移至视网膜的观察

目的观察脂质体是否能介导目的基因转移至视网膜及脂质体潜在的毒副作用,探讨脂质体在视网膜疾病基因治疗中的应用价值.方法通过体外细胞转染实验优化阳离子脂质体与质粒DNA的比例,然后将脂质体-DNA混合物注射至Spregue-Dawley(SD)及Royal college of surgeon(RCS)大鼠视网膜下间隙,荧光显微镜观察目的基因的表达,病理学检查及电镜观察视网膜的组织形态学变化.结果阳离子脂质体介导转移的绿色荧光蛋白表达质粒在视网膜细胞中表达时间>4周.但转染后4周,正常SD大鼠的光感受器外节开始出现肿胀变性;8周时光感受器的细胞核明显减少,仅剩单层细胞,外节脱落或消失;双极细胞也出现凋亡;视网膜内可见新生血管.5只4周龄的RCS大鼠经阳离子脂质体介导睫状体神经营养因子(cillary neurotrophic factor, CNTF)表达质粒转移至视网膜,3～5周时镜下见3只实验眼视网膜光感受器保存情况明显比对照眼好.结论阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至视网膜细胞内;脂质体介导的CNTF基因转移对RCS大鼠视网膜光感受器有一定的保护作用,但对正常的视网膜神经细胞特别是光感受器有一定的毒副作用.     

脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究

目的观察表达质粒色素上皮衍生因子（PEDF）-绿色荧光蛋白（GFP）以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位,探索合适的基因治疗给药方法。方法将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT—PCR方法检测PEDF表达情况。结果（1）BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后1d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周。RT—PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。（2）经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF—GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达,且分布更均匀,范围更广。第1、2周表达明显增强,到第4周仍有表达。RT—PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强。结论阳离子脂质体可以成功介导PEDF—GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中,并能够持续表达。视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径。本研究为视网膜,脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础。     

缺氧对视网膜Müller细胞中谷氨酸转运体及未折叠蛋白相关因子XBP1、CHOP表达的影响

目的研究体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞是否存在未折叠蛋白反应(unfol-dedprotein reaction,UPR),及其与L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartatetrans-porters,GLAST)的关系。方法出生3～7d大鼠视网膜组织采用胰蛋白酶消化法培养视网膜Müller细胞,氯化钴(CoCl2)200μmol·L-1对视网膜Müller细胞进行体外缺氧干预,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h;UPR诱导剂二硫苏糖醇(DTT)2mmol·L-1刺激视网膜Müller细胞为阳性对照,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。采用实时荧光定量PCR检测GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白的表达并分析其相关性。结果视网膜Müller细胞鉴定:细胞免疫荧光染色示90%以上细胞GS、GLAST表达阳性;流式细胞仪检测结果:Müller细胞的GLAST表达阳性率为(84.66±3.51)%。缺氧刺激后,GLAST与X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白在Müller细胞上均有表达,缺氧早期呈上升趋势,干预后24h表达最强,后呈下降趋势。DTT干预组表达趋势与缺氧干预组一致。结论体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在UPR,其相关因子的变化与GLAST的变化趋势一致,提示UPR可能是调控GLAST变化的原因之一。     

阳离子聚合物介导的质粒EGFP基因逆行转染视网膜神经节细胞

目的 研究上丘和外侧膝状体注射阳离子聚合体/质粒复合物转染视网膜神经节细胞（RGCs）的有效性.方法 将表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒和阳离子聚合物的混合溶液分别注射于Wistar大鼠双侧上丘和外侧膝状体,注射后10 d灌注固定大鼠,取视网膜和视神经行冰冻切片,荧光显微镜下观察.结果 荧光显微镜下见视网膜内层和视神经轴突纤维中有绿色荧光表达.结论 上丘和外侧膝状体注射阳离子复合物包装的质粒可将外源性基因相对高效地转入RGCs.     

巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和(或)nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.     

在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮细胞层和光感受器细胞层的实验研究

目的　探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮（RPE）细胞层和光感受器（PR）细胞层的可行性。方法　147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根据电穿孔刺激模式电压值分为5、10、15、20、25、30、35 V组,右眼视网膜下腔注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达质粒pEGFP N1为实验眼,左眼注射TE Buffer 为对照眼。各组根据不同转染方向再分为RPE和PR两个亚组。各组除电压不同外,其余参数均为脉宽99 ms,脉冲间期0.5 s,连续5个脉冲。将带有负电荷的质粒在电场作用下,拟转染到RPE细胞层,反向置电极,拟转染到PR细胞层。转染后7 d 取各组视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围及荧光细胞计数分析;采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）、实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达。结果　转染后7 d,荧光显微镜观察发现,各组RPE亚组对照眼RPE细胞层内均未见特异性荧光表达,实验眼可见绿色荧光表达;各组RPE亚组对照眼视网膜铺片均未见荧光表达,实验眼视网膜铺片均可见转染了EGFP的RPE细胞。Western blot检测显示,随电压增加,EGFP蛋白与β-肌动蛋白条带灰度相对比值呈上升趋势。RT-PCR检测显示,各组均产生阳性扩增条带,随电压增高,EGFP mRNA与GADPH mRNA扩增条带灰度相对比值逐渐增高。结论　在体电穿孔方法可以有效辅助基因转染大鼠RPE细胞层。      

体外诱导大鼠视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化的研究

目的 研究鼠视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后去分化为神经干细胞及进一步定向分化成神经节样细胞的特性.方法 实验研究.体外培养出生后7-10 d的Sprague Dawley大鼠视网膜Müller细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度.取培养的第3或4代Müller细胞,用含有N2、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的Delbeccon's modified Eagle's medium(DMEM)-F12干细胞条件培养基培养3～5 d后,再用含5%胎牛血清、脑源性神经营养因子和视黄酸的DMEM培养基诱导分化7～10 d,采用免疫荧光染色法分别鉴定去分化及再诱导分化后的细胞.结果 RT-PCR及免疫荧光染色结果显示,分离培养的视网膜Müller细胞纯度可达(95.17±2.68)%以上.干细胞条件培养基培养3～5 d后,大部分Müller细胞汇集形成细胞球,经免疫荧光染色法鉴定,显示细胞球内(95.26 ±1.35)%以上的细胞Nestin表达阳性,(90.33±4.12)%以上细胞BrdU表达阳性.将这些细胞球进一步诱导分化后,可见细胞球内细胞可向外扩展、铺开,分化出形态各异的细胞,其中约(21.14±1.49)%细胞表达神经节细胞特异性标记物Thy1.1阳性.结论 成年啮齿动物视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后,可以产生具有增殖能力和分化潜能的神经干细胞,并可进一步定向分化为神经节样细胞,这为干细胞研究和视神经再生治疗等提供了新的方法和手段.