人角质细胞生长因子的克隆及表达

目的为获得高表达的重组人角质细胞生长因子生物工程菌。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从人胚 胎肺成纤维细胞中,扩增出ＫＧＦ ｃＤＮＡ基因,并插入ｐＵＣ１８－Ｔ载体,构建成了重组人ＫＧＦ基因,经ＤＮＡ测序证实与 文献报道一致。将ＫＧＦ基因定向插入大肠杆菌表达载体ＰＥＴ１１ｂ内,转化大肠杆菌ＨＢ１０１。结果获得的重组子 经ＩＰＴＧ诱导,在相对分子质量为１９０００处表达重组蛋白,约占菌体蛋白的１０％。结论建立了制备重组人ＫＧＦ表 达系统,为今后进一步研究ＫＧＦ的生物学功能奠定可靠的物质基础。     

人血管生成素基因的克隆与表达

目的 为了获得人的血管生成素基因,并在原核表达系统中进行表达。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术 从人的肝脏组织中扩增出Ａｎｇ基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中进行序列分析,再亚克隆到原核表达到 ｐＥＴ２８ａ（＋）载体中。结果　构建了重组表达载体ｐＥＴＡ,转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后,经ＩＰＩＧ诱导,Ａｎｇ基因蛋白在 ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达了相对分子质量约为１７０００的重组蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明,外源蛋白的表达量 占菌体蛋白总量的１０．６４％。结论 Ａｎｇ基因的克隆与表达为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。     

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ,通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,诱导特异性 ＣＴＬ反应,当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平,构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。     

应用蛋白质工程法制备含硒单链抗体酶

目的 制备一种具有谷胱甘肽过氧化物酬（ＧＰＸ）活性的含硒单链抗体酶。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ方 法从杂交瘤细胞株２Ｆ３中扩增出单克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因。经ＤＮＡ序列测定后,构建成表达载体 ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ,经过金属螯合层析纯化、复性和化学诱变,得到含硒单链抗体酶。结果 将重组质粒ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ分别转 化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）和 ＢＬ２１（ｃｏｄｅｎ　ｐｌｕｓ）,表达目的蛋白分别占菌体总蛋白的５％－１０％、１５％－ ２０％和 ２５％－３０％。该重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为３００００。其 ＧＰＸ活性为３４００Ｕ／μｍｏｌ,接近天 然酌水平。结论 为工业化制备含硒单链抗体酶奠定基础。     

EXPERIMENTAL INVESTIGATION OF KINETIC AND TRANSPORT PARAMETERS IN A WALL－COOLED FIXED－BED REACTOR

ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＯＮＯＦＫＩＮＥＴＩＣＡＮＤＴＲＡＮＳＰＯＲＴＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳＩＮＡＷＡＬＬ－ＣＯＯＬＥＤＦＩＸＥＤ－ＢＥＤＲＥＡＣＴＯＲＺｈｅｎ－ＭｉｎＣＨＥＮＧａｎｄＷｅｉ－ＫａｎｇＹＵＡＮ（ＵＮＩＬＡＢＲｅｓｅ...     

THE PREPARATION OF HIGH－PURITY，ULTRAFINE AND MONODISPERSED TITANIUM DIOXIDE POWDER FROM TITANIUM TETRACHLORIDE BY HYDROLYSIS OF TITANIUM ALKOXIDES

ＴＨＥＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＯＦＨＩＧＨ－ＰＵＲＩＴＹ，ＵＬＴＲＡＦＩＮＥＡＮＤＭＯＮＯＤＩＳＰＥＲＳＥＤＴＩＴＡＮＩＵＭＤＩＯＸＩＤＥＰＯＷＤＥＲＦＲＯＭＴＩＴＡＮＩＵＭＴＥＴＲＡＣＨＬＯＲＩＤＥＢＹＨＹＤＲＯＬＹＳＩＳＯＦＴＩＴＡＮＩＵＭＡＬＫＯ...     

人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的　为了获得大量重组人血管内皮细胞生长因子（ Ｈｕｍａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ, ｈＶＥＧＦ）,以研究其在心血管和药学领域具有的潜在药用价值。方法　用ＰＣＲ方法扩增目的基因ｈＶＥＧＦ１６５,连接到 ｐＥＴ－３ａ载体上,并转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,建立可高效表达的ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ１６５重组质粒,经ＩＰＴＧ诱导表达, Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测表达产物的抗原性,通过 Ｍｏｎｏ Ｑ阴离子层析和ＦＰＬＧ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２分子筛柱层析,进行初步纯化,用 ＭＴＴ法检测其生物学活性。结果 　ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ表达产物经纯化后,其纯度可达到９０％以上,表达的ｒｈＥＶＧＦ１６５能 呈剂量依赖性地促进人静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的增殖。结论组建了天然形式ｈＥＶＧＦ１６５的大肠杆菌菌株,并摸索 出一套纯化工艺,为大规模生产重组ｈＥＶＧＦ１６５奠定了基础。     

胰高血糖素基因克隆、表达及鉴定

目的 研制基因工程胰高血糖素,用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血 糖反应。方法 依据人胰高血糖素氨基酸组成序列,采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子,体外合成胰高血 糖素基因序列,克隆于ｐＧＥＸ－１Ｎ质粒,转化人ＢＬ２１（ＤＥ３）菌中,对阳性克隆转化质粒进行ＤＮＡ测序。用ＩＰＴＧ诱导 转化的胰高血糖素工程菌,产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白,经谷胱苷肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析后,由 Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ酶 进行柱上切割,最后用ＲＰ－ＨＰＬＣ得到纯化产物。产品用质谱法测相对分子质量,并对Ｎ末端１５个氨基酸测序。 结果ＤＮＡ测序显示克隆基因序列正确,产品相对分子质量为３４８６Ｊ末端１５个氨基酸序列与理论值相同,产率为 １．９ｍｇ／Ｌ。结论 获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌,适于快速生产天然序列重组胰高血 糖素。     

CALIXE［4］ARENE AS A TEMPLATE FOR CONTROLLING REGIOCHEMISTRY OF PHOTODIMERIZATION OF 9－SUBSTITUTED AN

ＣＡＬＩＸＥ［４］ＡＲＥＮＥＡＳＡＴＥＭＰＬＡＴＥＦＯＲＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧＲＥＧＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＯＦＰＨＯＴＯＤＩＭＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦ９－ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤＡＮＴＨＲＡＣＥＮＥＬＩＹＩ；ＴＯＮＧＺＨＥＮ－ＨＥ（ＣＨＥＮ－ＨＯＴＵＮＧ...     

美国DUPONT与ACC腈纶二步法工艺的比较

利用聚合酶链式反应技术，从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ，并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克ｐＭＰ２－１，ｐＭＰ的Ｐ２ ｃＤＮＡ的进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本一致，只是在第１４８位碱基处发生置换，由Ｃ→Ｇ，而ｐＭＰ２－２的Ｐ２ｃＤＮＡ在１４８位碱基未发生改变，但在     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

人颗粒溶素活性片段原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人颗粒溶素(GNLY)活性片段原核表达载体。方法采用RT-PCR技术从健康人外周单个核细胞中扩增出颗粒溶素活性片段cDNA,将其与表达载体pGEX-4T-1经限制性核酸内切酶双酶切后连接,转化E.coliBL21,挑取阳性菌落,抽提重组质粒并鉴定。IPTG诱导表达GST融合蛋白,亲和层析纯化,SDS-PAGE分析表达和纯化结果,抑菌圈法鉴定表达产物的活性。结果重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶素活性片段cDNA。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量29000处出现一明显条带,与理论结果相符。抑菌试验表明,融合蛋白分子凝血酶切产物对革兰阳性的金黄色葡萄球菌ATCC25938有抑制作用。结论已成功构建了人颗粒溶素活性片段原核表达载体,为进一步研究其抗菌、抗肿瘤作用奠定了基础。     

人T淋巴细胞CD3ε链的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人T淋巴细胞CD3ε(hCD3ε)链。方法以健康成人外周血单个核细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增人CD3ε链基因,并克隆入pCR-II载体,酶切鉴定及测序分析后,再定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-hCD3ε,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果酶切分析及DNA测序证实,hCD3ε链基因被正确克隆入pGEX-4T-3载体,并能在原核系统中稳定表达。表达产物的相对分子质量为49 500,0.2 mmol/L IPTG 25℃诱导表达4.5 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的29.3%,其中可溶性表达占12.8%。纯化的融合蛋白纯度可达86.1%,可分别被兔抗人CD3ε多抗和羊抗GST多抗识别。结论已成功地原核表达并纯化了GST-hCD3ε融合蛋白。     

蜂毒明肽的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。     

人溶菌酶基因的原核表达及其生物学活性

目的在大肠杆菌中表达人溶菌酶(hLYZ)基因,并检测其生物学活性。方法将人溶菌酶基因克隆至带有GST融合标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并用溶壁微球菌比浊法检测酶活性,热激法检测其生物学活性。结果经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒pGEX-4T-hLYZ构建正确。SDS-PAGE显示,在相对分子质量约40000处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的46.5%,目的蛋白在裂解沉淀中占17.0%,在裂解上清中占58.3%,主要以可溶形式表达。纯化后,重组蛋白纯度可达95%以上,且具有良好的反应原性。重组hLYZ酶活性为2389U/mg,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性重组人溶菌酶,且具有较高的生物学活性。     

人心肌肌酸激酶MB同工酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人心肌肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)。方法分别从含CK-M、CK-B基因片段的质粒SC319293和SC119007中扩增CK-M、CK-B基因,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,经GST亲和层析柱纯化后,ELISA法检测其抗原性。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组CK-MB蛋白相对分子质量约110 000,表达量占菌体总蛋白的57%,主要以包涵体形式存在;纯化的CK-MB蛋白纯度大于90%,可与兔抗CK-B、CK-M多克隆抗体特异性结合。结论成功原核表达并纯化了重组CK-MB蛋白,为其大量生产奠定了基础。     

人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化

目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化。方法分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致。所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%。经纯化后,纯度达85%以上。Westernblot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应。结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础。