靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...     

RNAi靶向抑制HBV复制和HBeAg表达

目的观察靶向HBVC基因区的RNA干扰对HBV复制的抑制作用。方法选择HBV基因组C区的Nt2021-2049作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBV的受抑制情况。结果病毒复制及HBeAg的表达明显受到抑制。结论所选靶区通过RNA干扰可有效抑制HBV复制。     

靶向C基因的shRNA抗乙型肝炎病毒在BHK-21细胞中的复制与表达

目的 研究靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的shRNA(shRNA)诱导RNAi(RNAi)在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果.方法 根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组(基因型B属ayw1亚型)已在GenBank登录注册:CYN/2002和CYN/2000(GenBank登录号AY517488,AY517489,等),为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B(-),设计并构建两个靶向同源(CYN/2002和CYN/2000)毒株HBV C基因的长24核苷酸(nt)的shRNA表达质粒(S1和S2),随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的 shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞.首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(EGFP)表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)进一步检验了shRNA抗病毒效果.结果 通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组、S1+S2的共转染组使EGFP的表达水平降低了90%,而对照质粒S3或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达水平,差异有统计学意义(P＜0.01);应用RT-PCR检测C基因mRNA和EGFP基因mRNA的表达量,结果与BH-2型荧光显微镜和FACS-440型流式细胞仪检测结果相吻合,差异有统计学意义(P＜0.01).进一步证实了RNAi抗病毒效果,抗病毒效应持续时间超过48 h.结果 发现,创建的靶向C基因的shRNA能够有效特异地抗C-EGFP基因在BHK-21细胞中的复制与表达.结论 靶向C基因的RNAi技术能够有效特异地抗HBV在BHK-21细胞中的复制与表达.RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV安全有效的应急疫苗.     

Stealth siRNA对HBV复制和表达的抑制

目的设计siRNA并检测其对HBV的抑制作用。方法针对HBV基因组设计siRNA基因序列,化学修饰合成3种Stealth siRNA,转染带有HBV的2．2．15细胞,ELISA法检测其对HBV复制和表达的影响。结果3种Stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。72h后就可检测出抑制,其中siRNA508效果最显著。结论合成的Stealth siRNA可以抑制HBV的复制和表达,有望成为控制HBV感染的一种手段。     

用于抗HBV RNAi重组质粒的构建

目的构建针对乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的siRNA表达载体pSuper-HBV,以用于后继的RNAi研究.方法根据RNA作用原理设计,针对HBV S/C区的相应序列,再将其克隆入含聚合酶Ⅲ H1-RNA启动子的表达载体pSuper.结果经酶切鉴定、电泳和测序分析证明,含作用序列的重组质粒pSuper-HBVs/pSuper-HBVc及随机序列对照组pSuper-HBVcontrol构建是成功的.结论用于抗HBV RNAi的重组质粒可于体外成功构建,但仍需进一步实验来确定最佳作用靶点.     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。     

RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达

目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHV)序列特异性siRNA对WHV X基因表达的抑制作用。方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHV X基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3H-WHx);合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2);质粒pXF3H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达。结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90%以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失。结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达。     

S区和C区小干扰RNA在小鼠体内抗乙型肝炎病毒的作用

目的:以乙型肝炎病毒(HBV)S区和C区为靶位,观察小干扰RNA(siRNA)在小鼠体内抗HBV的作用.方法:以流体动力学法建立HBV感染的动物模型,将pcDNA3.1-HBV和细胞体外实验证明有效的S区和C区siRNA尾静脉注射BALB/c小鼠,用时间分辨免疫荧光分析法(IFMA)检测小鼠血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg),用定量PCR法(FQ-PCR)检测血清HBV DNA,用RT-PCR法检测HBV S-mRNA和C-mRNA. 结果:在小鼠体内,和无关siRNA相比,S区和C区siRNA均能有效抑制血清中HBsAg的分泌(第1天的抑制率分别为96%和90%),降低HBV DNA的滴度(第1天分别减少47%和71%),HBV S-mRNA和C-mRNA的条带灰度明显减少,干扰效果至少持续3 d. 结论:在小鼠体内靶向HBV S区和C区的siRNA均能有效特异抑制HBV.     

siRNA联合恩替卡韦在原代肝细胞中抑制土拨鼠肝炎病毒基因表达和复制

目的:在原代土拨鼠肝细胞中研究siRNA联合恩替卡韦(ETV)对土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因表达和复制的抑制作用。方法:分别设计合成针对WHV PreS1、S、C、X基因的4种siRNA,转染原代土拨鼠肝细胞,同时给予ETV处理,Southern和Northern印迹检测WHV病毒复制中间体和mRNA水平,realtime PCR检测细胞上清中WHV DNA。结果:4种siRNA对WHV基因表达和复制的作用显示出不同的动力学特征,siWHs和siWHx的抑制作用最强,而siWHpreS1和siWHc的活性相对较弱。在原代肝细胞中,首先出现的是WHV mRNA水平的降低,然后是WHV复制中间体水平的降低,siWHs和siWHx最高抑制60%～70%的mRNA和病毒复制中间体,同时抑制细胞上清中90%的WHV DNA。另外siWHx与ETV联合应用不仅可以增强抗病毒作用,而且可以防止ETV停药反跳。结论:siRNA在WHV自然感染的原代肝细胞中可以有效抑制病毒的基因表达和复制,因而siRNA有可能开发成为新的抗HBV药物,尤其适用于核苷(酸)类似物的联合应用。     

Characteristics of short double stranded RNA against hepatitis C virus： a literature-based analysis

Objective: To describe the characteristics of short interfering double stranded RNA (dsRNA) against hepatitis C virus (HCV) and to find out the determining factors in design for desirable inhibitory efficacy. Methods: The data were collected and analyzed by retrieval of 229 published short dsRNAs designed for degradation of HCV RNA. Results: Statistical analyses showed that the most frequently involved short dsRNAs were directing against 5′NTR/core and genotype 1b, accounting for 64.2% and 69.9%, respectively. Inhibitory efficacy varied with the structural characteristics of short dsRNAs, of which the most potential were those directed against HCV core region with inhibitory efficacy of 70.2%. Moreover, the mean inhibitory efficacy of short dsRNAs with GC contents from 30% to 52% was higher than that of those with GC contents out of this range. Conclusion: Based on this pooled data in a relatively large sample, the present results provided clues to design for short dsRNAs with more potent inhibitory efficacy.     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

乙型肝炎病毒X基因蛋白诱导人类白细胞抗原DR表达

乙型肝炎病毒(HBV)所致的肝细胞坏死,被认为是与人类白细胞抗原(HLA)有关的MHC限制的T细胞为主的免疫应答的结果。本研究证实,转染HBV基因组或X基因后的人肝癌细胞系可诱导HLAⅡ(即HLA DR)表达。核转录及RNA杂交分析提示表达X基因的细胞其HLA DR mRNA水平增加,X蛋白增加该基因的转录。氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因分析进一步提示,X蛋白通过作用于HLA DR基因上游的调节序列诱导HLA DR表达。结果表明:X蛋白可能通过调节HLA DR表达参与HBV感染的免疫发病机理。     

乙型肝炎病毒基因型别及X基因变异的研究进展

乙型肝炎病毒是一个以RNA为中间体的反转录复制病毒,由于RNA聚合酶缺乏校正功能,这使其突变率明显高于一般的DNA病毒,随着分子生物学研究技术的进展,不断有新的HBV基因型和亚型被发现。对和疾病进程、治疗相关的HBV基因型和X基因变异进行研究,有助于对疾病的控制和治疗提供更好的理论依据,在控制HBV感染上具有重要的意义。     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

河北唐山地区乙肝患者血清标志物七项与乙型肝炎病毒DNA定量的对比研究

目的探讨唐山地区人群血清中的乙型肝炎病毒(HBV)标志物七项与HBV DNA定量之间的对应关系。方法选择2007年7月至2008年1月唐山市传染病医院收治的门诊和住院的乙型肝炎患者758例,对758例血清标本同时进行HBV血清学标志物(HBVm)七项测定和HBV DNA实时荧光定量测定(FQ-PCR),并对结果进行统计学分析。结果在6例HBVm七项(1,3)阳性的标本中,检测出HBV DNA阳性6例,检出率为100%,载量均数为1.63×108拷贝/mL;在162例HBVm七项(1,3,5,7)阳性的标本中,检测出HBV DNA阳性144例,检出率为88.89%,载量均数为3.10×107拷贝/mL;在91例HBVm七项(1,3,5)阳性的标本中,检测出HBV DNA阳性85例,检出率为93.41%,载量均数为7.61×107拷贝/mL;在6例HBVm七项(1,3,7)阳性的标本中,检测出HBV DNA阳性7例,检出率为100%,平均载量为7.96×107拷贝/mL;在8例HBVm七项(2,4,5)阳性的标本中,检测出HBV DNA阳性1例,检出率为12.5%;在6例HBVm七项全阴性的标本中,仍有1例HBV DNA阳性;在10例HBVm七项(2)阳性的标本中,还检出了HBV DNA阳性2例。结论在HBV多种血清学标志物类型中,以HBVm七项(1,3)阳性的HBV复制水平最高;在HBVm七项(4,5)和HBVm七项(5)阳性的血清中仍然存在HBV DNA阳性标本,复制水平中等;而HBVm七项全阴性和HBVm七项(2)阳性的血清并不能排除HBV感染。