LncRNA MEG3在骨肉瘤组织中的表达及对MG-63细胞增殖、凋亡与侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA母系印记基因3(lncRNA MEG3)在骨肉瘤组织中的表达及对人骨肉瘤细胞MG-63增殖、凋亡与侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测5例骨肉瘤组织及癌旁对应正常组织中lncRNA MEG3的表达水平。构建pcDNA3.1-MEG3重组质粒,MEG3过表达后,MTT方法检测MG63细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测MG63细胞的凋亡率;Transwell实验检测MG63细胞侵袭能力的变化;Western blot方法检测MG63细胞增殖细胞核抗原(PCNA)与Racl蛋白的表达变化。结果 lncRNA MEG3在骨肉瘤组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P0.01)。lncRNA MEG3过表达后,MG63细胞的增殖与侵袭能力显著降低,凋亡率显著上升,PCNA与Racl蛋白的表达显著降低(P0.01)。结论 lncRNA MEG3在骨肉瘤组织中低表达,过表达lncRNA MEG3能够抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖与侵袭,并促进凋亡。     

沉默长链非编码RNA CCAT2对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响

目的探讨靶向沉默长链非编码RNA肠癌相关转录子2(lncRNA CCAT2)对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测骨肉瘤MG63细胞与人成骨hFOB1.19细胞中lncRNA CCAT2表达水平;转染小干扰RNA沉默MG63细胞中lncRNA CCAT2的表达,qPCR方法验证沉默效率。沉默MG63细胞中lncRNA CCAT2表达后,MTT方法检测MG63细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测MG63细胞的凋亡率,Western blot方法检测MG63细胞p53及Bcl-2蛋白的表达变化。结果lncRNA CCAT2在骨肉瘤MG63细胞中的表达显著高于人成骨hFOB1.19细胞(P<0.01);转染小干扰RNA能够显著降低MG63细胞中lncRNA CCAT2的表达水平(P<0.01)。沉默lncRNA CCAT2后,MG63细胞的增殖能力显著降低,凋亡率显著上升,Bcl-2蛋白表达显著降低p53蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论靶向沉默lncRNA CCAT2能够抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖并诱导凋亡。     

沉默HAX1基因对人骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的观察HS1相关蛋白X-1(HS1-associated protein X-1,HAX1)对骨肉瘤细胞凋亡的影响。方法应用基因沉默技术在骨肉瘤细胞系MG63中下调HAX1基因的表达,并且通过Western blot实验与免疫荧光实验检测基因沉默效率;应用MTT方法及克隆形成实验,评价沉默HAX1基因对MG63细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡并通过Western blot实验检测下游蛋白的表达变化。结果沉默HAX1基因抑制人骨肉瘤细胞系MG63的增殖能力与克隆形成能力,流式细胞技术显示沉默HAX1可以诱导MG63细胞凋亡,Western blot实验说明HAX1诱导的MG63细胞凋亡与caspase3和caspase9蛋白上调相关。结论 HAX1可能是维持骨肉瘤细胞增殖能力的关键基因,沉默该基因诱导骨肉瘤细胞凋亡可能与caspase3/caspase9上调相关。     

穿心莲内酯对骨肉瘤143B细胞的抑制作用及其机制

目的:探究穿心莲内脂(AG)对人骨肉瘤143B细胞的抑制作用及其潜在的机制。方法:体外培养人骨肉瘤143B细胞,使用不同浓度(0~20μmol/L)的AG处理143B细胞,分别用结晶紫染色、MTT法和集落形成实验来检测AG对143B细胞增殖的影响。划痕愈合实验检测骨肉瘤143B细胞的迁移能力。Transwell小室实验检测骨肉瘤143B细胞的侵袭能力。Hoechst 33258染色实验和流式细胞术检测AG对骨肉瘤细胞凋亡的影响。不同浓度AG处理后,使用Western blot检测骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的水平。应用Western blot进一步检测Wnt信号通路中的β-catenin及其相关分子c-Myc的表达量。结果:与空白组相比,AG处理组中143B骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.05),且呈浓度依赖性。迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶9(MMP-9)、波形蛋白(vimentin)和Snail蛋白的水平均下调(均P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达量升高,凋亡相关蛋白caspase-3的蛋白水平下降而cleaved caspase-3的蛋白水平升高,同时Wnt信号通路相关蛋白β-catenin和c-Myc的表达水平均明显下调(P<0.01)。结论:穿心莲内酯可能通过抑制Wnt信号通路的活性,从而达到抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭能力,并且促进其凋亡。     

分化抑制因子Idl对骨肉瘤细胞增殖的影响

目的探讨分化抑制因子Idl对骨肉瘤细胞增殖的影响及可能的途径。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTY）法检测Idl表达调节后MG．63细胞增殖变化情况;采用流式细胞术检测Idl下调表达后,MG．63细胞凋亡及细胞周期变化情况;Westemblotting技术检测Idl下调表达后对p-AKT水平的影响。结果本实验利用RNA干扰技术下调骨肉瘤细胞系Idl表达后,可以明显抑制MG．63细胞的增殖,p-AKT的水平也显示下降,流式细胞术证明下调后Idl的水平可以一定程度地调节细胞凋亡水平,而对细胞周期无明显影响,另外进一步构建了Idl的真核表达质粒,转染Idl过表达质粒后。并未见骨肉瘤细胞明显地增殖加速。结论分化抑制因子Idl可能通过影响AKT信号通路进而影响了骨肉瘤细胞的增殖。     

延龄草总皂苷通过促进人β防御素2(HBD-2)的表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移

目的探讨延龄草总皂苷调控人β防御素2(HBD-2)对HuH-7细胞侵袭和迁移的影响和机制。方法采用(0.5、 1.0、 2.0、 4.0)mg/L延龄草总皂苷处理HuH-7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖, Transwell~(TM)小室测定细胞侵袭和迁移能力, Western blot法检测细胞中HBD-2、基质金属蛋白酶2(MMP2)、 MMP9的蛋白水平。将HBD-2小干扰RNA(siRNA)转染至HuH-7细胞中,用延龄草总皂苷处理,实时定量PCR和Western blot法验证干扰效果, Transwell~(TM)法分别检测细胞侵袭和迁移能力。结果除0.5 mg/L延龄草总皂苷对HuH-7细胞增殖无影响外,其他各剂量延龄草总皂苷均可抑制HuH-7细胞增殖。(0.5、 1.0)mg/L的延龄草总皂苷处理均可下调细胞MMP2、 MMP9蛋白水平、增加HBD-2蛋白水平并抑制细胞侵袭和迁移。HBD-2 siRNA转染可明显降低HuH-7细胞HBD-2水平。下调HBD-2提高延龄草总皂苷处理的HuH-7细胞侵袭和迁移能力并增加细胞MMP2、 MMP9蛋白水平。结论延龄草总皂苷通过促进HBD-2表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移。     

敲低dachshund同源物1(DACH1)促进Capan-1胰腺癌细胞凋亡并抑制其侵袭和迁移

目的探讨抑制dachshund同源物1(DACH1)的表达对Capan-1胰腺癌细胞周期、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法设计合成针对人DACH1基因的4条小干扰RNA(si RNA),退火形成双链短发夹RNA(shRNA),插入p Genesil-1载体中,构建成重组质粒,进行酶切及测序鉴定,通过脂质体介导转染入Capan-1细胞,利用荧光显微镜、反转录PCR和Western blot法检测其转染表达效率。藻红蛋白标记的膜联蛋白Ⅴ和7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7AAD)双标记结合流式细胞术检测Capan-1细胞凋亡和流式细胞术检测细胞周期,TranswellTM侵袭、迁移实验检测Capan-1细胞侵袭迁移能力。结果成功构建并筛选出干扰质粒pshRNA-DACH1,将其转染Capan-1胰腺癌细胞后,成功下调Capan-1细胞DACH1水平,同时细胞凋亡明显增加,而对细胞周期无明显影响。下调DACH1表达后细胞侵袭和迁移能力均降低。结论敲低DACH1基因表达能显著促进胰腺癌细胞Capan-1凋亡,抑制其侵袭及迁移。     

miR-33a-5p 靶向SMAD7 对血管平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移及细胞外 基质降解的影响

目的:探究miR-33a-5p靶向SMAD7对血管平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移及细胞外基质降解的影响。方法:生物信息学预测靶向关系,荧光素实验进一步验证靶向关系,RT-PCR检测miR-33a-5p和SMAD7的表达,CCK-8法检测VSMC的增殖,流式检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,Western blot检测Ki67、PCNA、Caspase-3、 Caspase-9、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。结果:PDGF-bb处理能够增强血管平滑肌细胞增殖,抑制miR-33的表达;miR-33a-5p与SMAD7在3′UTR区存在结合位点,miR-33a-5p直接靶向作用于SMAD7,且miR-33a-5p过表达抑制SMAD7的表达;miR-33a-5p靶向SMAD7抑制PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞增殖、下调增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达,促进细胞凋亡、上调凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达,降低伤口愈合率、抑制细胞迁移,下调MMP-2和MMP-9的表达(P0.01)。结论:miR-33a-5p靶向SMAD7抑制PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞外基质的降解,并促进凋亡。     

沉默Cat D对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及相关信号通路

研究组织蛋白酶D(cathepsin D,Cat D)在骨肉瘤细胞中的表达，并通过shRNA技术沉默Cat D,探讨该分子对骨肉瘤细胞MG63和U2OS增殖、凋亡及侵袭的作用和机制。构建sh-Cat D质粒及阴性对照质粒sh-NC并转染至骨肉瘤细胞MG63和U2OS中，RT-PCR和Western blotting检测Cat D在骨肉瘤细胞中的表达；CCK-8法、克隆形成实验和EdU荧光染色实验检测骨肉瘤细胞的增殖活性；Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力；FACS检测肿瘤细胞的凋亡情况；Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达及Akt/mTOR信号通路相关蛋白(Akt和mTOR)的磷酸化水平。结果显示，相较健康人成骨细胞hFOB,Cat D在骨肉瘤细胞中的表达显著升高，尤其是MG63和U2OS细胞中Cat D的高表达均显著(均P<0.001)。与sh-NC组相比，Cat D沉默显著抑制MG63和U2OS细胞的增殖和侵袭(均P<0.001)。与sh-NC组相比，Cat D沉默通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达促进肿瘤细胞的...     

HOXB7基因沉默对人胃癌细胞活力、迁移和侵袭的影响

目的:探讨靶向沉默HOXB7基因对人胃癌SGC-7901细胞活力、迁移和侵袭作用的影响及潜在机制。方法:设计靶向HOXB7的siRNA,然后瞬时转染胃癌SGC-7901细胞,实时荧光定量PCR和Western blot法检测siRNA靶向沉默的效果。MTT法检测细胞的活力,Western blot法检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1蛋白的表达水平,Transwell小室侵袭实验检测SGC-7901细胞的侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western blot法检测胃癌SGC-7901细胞PTEN和VEGF的表达水平以及p-AKT的蛋白水平。结果:胃癌组织中HOXB7基因在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组织。siRNA可有效靶向沉默SGC-7901细胞中HOXB7的表达,且沉默HOXB7表达后SGC-7901细胞活力明显下降,同时细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1的表达亦下调。靶向沉默HOXB7可明显抑制SGC-7901细胞中AKT的磷酸化水平,抑制胃癌细胞的侵袭转移,同时下调VEGF的表达水平,抑制胃癌组织中的肿瘤血管生成。结论:HOXB7作为一个癌基因,可上调细胞周期相关蛋白CDK4、cyclin D1和侵袭相关分子VEGF的表达,上调AKT的磷酸化水平,进而抑制PTEN的功能,促进胃癌细胞SGC-7901的生长、迁移和侵袭能力。     

大麻素WIN55,212-2抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖和侵袭迁移

目的研究大麻素WIN55,212-2(WIN)对SMMC-7721肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并探讨其分子机制。方法应用CCK-8法分析(0、1、5、10、20)μmol/L WIN对SMMC-7721细胞活力的影响;Hoechst33258染色荧光显微镜下观察各组细胞形态改变;异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白P53、P21、Bcl-2、Bax和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)的表达;采用TranswellTM侵袭实验及划痕实验检测细胞侵袭、迁移的能力,Western blot法检测基质金属蛋白酶14(MMP-14)蛋白水平。结果 WIN抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡,两者都具有剂量依赖性;WIN处理后的细胞,经Hoechst33258染色,可发现细胞核浓缩、破碎,引起明显细胞凋亡;凋亡相关蛋白P53、P21、Bax激活,抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降;AKT、p-AKT、p-ERK水平下降,而ERK总蛋白无明显变化;与对照组比较,WIN处理后的SMMC-7721细胞侵袭和迁移的能力均显著降低,MMP-14蛋白水平也下降。结论 WIN能抑制SMMC-7721细胞增殖和诱导其凋亡,与WIN激活P53,抑制AKT、p-AKT、p-ERK表达有关。WIN通过下调MMP-14蛋白水平,抑制SMMC-7721细胞侵袭和迁移。     

沉默PKM2对乳腺癌他莫昔芬耐药MCF-7细胞系侵袭及迁移的影响

目的探讨PKM2下调对乳腺癌他莫昔芬(TAM)耐药MCF-7细胞系侵袭、迁移的影响。方法以浓度梯度法诱导获得乳腺癌他莫昔芬耐药细胞系(MCF-7R);细胞增殖与凋亡试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖能力;Western blot检测细胞PKM2的表达;将表达针对PKM2的shRNA慢病毒干扰载体感染耐药细胞系,RT-q PCR、Western blot验证干扰效果,分别用Transwell侵袭实验、划痕实验检测细胞侵袭、迁移能力。结果与MCF-7细胞相比,MCF-7R细胞对他莫昔芬的抵抗能力显著增强(P0.01),PKM2的表达水平明显升高(P0.01)。稳定干扰PKM2的耐药细胞中PKM2的mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P0.01),PKM2干扰后可明显抑制MCF-7R细胞的侵袭、迁移能力(P0.01)。结论 MCF-7R细胞中PKM2表达明显高于MCF-7细胞,沉默PKM2可以抑制MCF-7R细胞的侵袭和迁移能力。     

木香烃内酯通过内质网应激和自噬诱导骨肉瘤细胞凋亡北大核心CSCD

目的:探讨木香烃内酯(Cos)对骨肉瘤(OS)细胞凋亡的影响及其相关分子机制。方法:体外培养MG63细胞,采用不同浓度(5、10、15、20、25、40μmol/L)Cos处理MG63细胞48 h。CCK-8法检测细胞增殖抑制率,划痕试验检测细胞迁移能力,Transwell小室法测定细胞侵袭能力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western blot法检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2结合抗凋亡基因(Bax)、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、真核生物翻译起始因子2α(eIF2α)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及微管相关蛋白轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)、Beclin-1、p62蛋白表达水平。结果:Cos显著降低MG36细胞增殖活力,且其抑制作用呈浓度和时间依赖性(P<0.05)。Cos显著降低MG36细胞迁移、侵袭能力,提高细胞凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05)。Cos可显著上调MG36细胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表达水平,上调MG36细胞中LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平,下调p62蛋白表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。Cos显著下调Bcl-2蛋白表达水平,上调Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05);内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDC)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)均可逆转Cos对MG36细胞凋亡相关蛋白的调控作用。结论:Cos通过介导OS细胞内质网应激和自噬促进OS细胞凋亡。     

靶向干扰GPx1基因对人胶质母细胞瘤细胞生长和迁移的影响

目的:探讨靶向上调和下调谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)对人胶质母细胞瘤细胞株(U87MG、U118MG)增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:合成针对GPx1的siRNA和构建、鉴定pc DNA3.1-GPx1重组质粒,分别用LipofectamineTM2000脂质体瞬时转染人胶质母细胞瘤细胞株U87MG和U118MG。Real-time PCR检测U87MG和U118MG中GPx1 mRNA表达。Western blotting法检测转染后GPx1蛋白表达,用MTS检测法和Transwell实验分别检测转染后细胞的活力、迁移及侵袭能力的变化。结果:siRNA干扰U87MG细胞后在24 h、48 h和72 h对细胞活力的抑制率分别为25.9%、35.7%和34.8%,较对照组明显降低(P0.05);质粒转染U118MG细胞后在24 h、48 h和72 h对细胞活力的促进率分别为22.7%、45.8%和39.8%,较对照组明显增加(P0.05);Transwell结果显示经siRNA干扰,U87MG细胞迁移抑制率为41.6%±8.2%,细胞侵袭抑制率为40.4%±10.1%,经siRNA干扰的细胞迁移和侵袭能力明显下降(P0.05);质粒转染后细胞迁移促进率为55.8%±9.8%,细胞侵袭促进率为60.8%±9.2%,经质粒转染的细胞的迁移和侵袭能力显著增强(P0.05)。结论:siRNA下调GPx1表达可抑制人胶质母细胞瘤细胞株U87MG的生长、迁移和侵袭;相反,质粒上调GPx1表达可促进人胶质母细胞瘤细胞株U118MG的生长、迁移和侵袭。     

下调含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1(UHRF1)的水平可抑制肾癌769-P细胞增殖并促进其凋亡

目的利用针对含植物同源结构域和环指结构域泛素样蛋白1(UHRF1)的小干扰RNA(siRNA)在肾癌769-P细胞中下调UHRF1的表达,探讨其对769-P细胞增殖和凋亡的影响。方法根据人UHRF1的mRNA序列设计并合成2对针对UHRF1的siRNA,用脂质体将其瞬时转染入769-P细胞。利用实时定量PCR检测UHRF1 mRNA的水平,Western blot法检测UHRF1的蛋白水平;利用MTT法检测细胞增殖,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)染色结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果 UHRF1 siRNA可显著抑制UHRF1的mRNA和蛋白水平,下调769-P细胞UHRF1水平后,细胞增殖显著减弱,细胞凋亡显著增加。结论下调UHRF1的表达可抑制肾癌细胞的增殖并促进其凋亡。     

miR-490-5p 靶向SP1 抑制骨肉瘤的发生发展

目的:研究miR-490-5p对骨肉瘤细胞生长和运动的作用。方法:体外实验设置control组、mimic-NC组、miR-490-5p mimic组、SP1组、mimic+SP1组,通过Lipofectamine 2000将质粒分别或联合转染进入各组骨肉瘤MG63细胞,运用基因预测软件预测靶基因,荧光素实验验证靶向关系,RT-qPCR检测miR-490-5p和SP1的表达,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测Ki67、PCNA、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin的表达,Transwell检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移;体内实验设置Control组和miR-490-5p mimic组,分别在裸鼠右后肢腹侧皮下注射0.2 ml骨肉瘤MG63细胞和转染miR-490-5p mimic的骨肉瘤MG63细胞悬液,第30天颈椎脱位法处死裸鼠,电子天平称肿瘤重量,Western blot检测Ki67、Bax、caspase-3、E-cadherin蛋白表达情况。结果:miR-490-5p在骨肉瘤细胞MG63中低表达,miR-490-5p与SP1在3′UTR区存在结合位点,miR-490-5p直接靶向作用于SP1,且miR-490-5p过表达抑制SP1表达;在体外,miR-490-5p过表达明显降低骨肉瘤MG63细胞生长速度,下调Ki67、PCNA和Bcl-2表达,上调Bax、caspase-3和caspase-9表达,减少侵袭细胞数目,增宽划痕,降低愈合率,上调E-cadherin表达,下调N-cadherin表达;在体内,miR-490-5p过表达减轻肿瘤重量,降低Ki67、Bax和caspase-3的表达,升高E-cadherin表达。结论:miR-490-5p靶向SP1抑制骨肉瘤细胞MG63生长和运动。     

长链非编码RNA TINCR 通过miR-7调控肝癌细胞系Huh7侵袭和迁移

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)组织分化诱导非蛋白质编码RNA(TINCR)通过miR-7调控肝癌Huh7细胞侵袭和迁移的机制。方法 Real-time PCR测定Huh7细胞中TINCR表达。Huh7细胞中转染TINCR shRNA,CCK-8法测定增殖;Transwell小室法测定侵袭和迁移;Western blot测定MMP-2和MMP-9蛋白表达。生物信息学软件预测发现TINCR和miR-7有结合位点,荧光素酶报告系统鉴定二者靶向关系。Huh7细胞中共转染miR-7 inhibitor和TINCR shRNA,利用上述方法测定细胞增殖、迁移和侵袭变化。结果肝癌细胞中TINCR表达水平明显高于正常肝细胞(P0.05)。转染TINCR shRNA后的Huh7细胞中TINCR水平降低(P0.05),细胞增殖、迁移以及侵袭能力均下降(P0.05),细胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平也降低(P0.05)。TINCR靶向负调控miR-7表达。miR-7 inhibitor可以提高下调TINCR后的肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力以及MMP-2、MMP-9蛋白表达水平(P0.05)。结论下调TINCR可以通过靶向促进miR-7表达抑制肝癌细胞Huh7侵袭和迁移。     

靶向抑制miR-20b降低肝癌HuH-7细胞增殖、迁移和侵袭能力

目的探讨miR-20b对肝癌HuH-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响和机制。方法在肝癌HuH-7细胞中转染miR-20b inhibitor,分别采用Real-time PCR评估下调效果,MTT法评估细胞增殖变化,Transwell小室评估细胞侵袭能力,Western blot法评估细胞中MMP-2、E-cadherin、MMP-9和vimentin蛋白水平。应用生物信息学软件预测TCF21可能是miR-20b的靶基因,以双荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。在肝癌HuH-7细胞中共转染TCF21 siRNA和miR-20b inhibitor,评估细胞增殖、侵袭、迁移与细胞中MMP-2、E-cadherin、MMP-9、vimentin蛋白的表达水平。结果转染miR-20b inhibitor后HuH-7细胞中miR-20b表达水平降低[(1.02±0.11)vs(0.43±0.05)];细胞增殖[(0.57±0.06)vs(0.34±0.02)]、迁移[(125.64±13.65)vs(92.14±6.94)]和侵袭[(88.15±9.32)vs(63.48±6.2)]能力下降;MMP-2、vimentin、MMP-9蛋白表达水平降低;E-cadherin蛋白表达水平升高。miR-20b靶向负调控TCF21表达。共转染TCF21 siRNA和miR-20b inhibitor可以显著提高HuH-7细胞增殖[(0.40±0.05)vs(0.56±0.06)]、迁移[(89.62±9.25)vs(115.26±10.84)]和侵袭[(68.25±4.15)vs 95.21±6.51)]能力;提高细胞中MMP-2、vimentin、MMP-9蛋白表达水平,降低E-cadherin蛋白水平;与共转染siRNA control和miR-20b inhibitor的细胞比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论下调miR-20b表达,可通过靶向TCF21抑制肝癌HuH-7细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化。     

敲低3-磷酸甘油酸脱氢酶靶向能量代谢逆转骨肉瘤恶性生物学的行为

目的 探讨敲低3-磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH) 靶向能量代谢对人骨肉瘤143B细胞恶性生物学行为及成骨分化的影响。 方法 Real-time PCR及Western blotting检测PHGDH在成骨细胞hFOB1.19和不同恶性程度骨肉瘤细胞TE85、MG63、143B中的表达。采用脂质体转染法将短发夹RNA（shRNA）-PHGDH重组质粒转染至143B细胞中, Real-time PCR和Western blotting检测PHGDH的表达变化；结晶紫染色法、细胞计数法、CCK-8实验检测细胞增殖；划痕实验检测细胞平行迁移能力，Transwell实验检测细胞垂直迁移及侵袭能力；Annexin V-FITC/PI双染法、DAPI染色法检测细胞凋亡；碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S染色检测成骨分化作用,Western blotting检测成骨分化指标Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OC)的表达情况；Real-time PCR检测能量代谢相关基因葡萄糖转运蛋白1（(GLUT1）、6-磷酸果糖激酶1（PFK1）、M2型丙酮酸激酶（PKM2）、乳酸脱氢酶A（LDHA)的表达，乳酸检测试剂盒测定乳酸分泌量，三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒检测ATP产生量。 结果 PHGDH在143B细胞中的表达明显高于在hFOB1.19、MG63和TE85细胞中(P<0.01)；转染shRNA-PHGDH重组质粒使143B细胞中的PHGDH表达量降低(P<0.01)、增殖能力降低(P<0.01)、细胞迁移及侵袭能力减低(P<0.01)、凋亡率增高(P<0.01)、ALP染色阳性率增加(P<0.01)、茜素红染色阳性率增加(P＜0.05)、Runx2(P<0.05)和OC的表达增高(P<0.01)、能量代谢相关基因(GLUT1、PFK1、PKM2、LDHA)的表达下调(P<0.01)、乳酸减少(P<0.01)、ATP增多(P<0.05)。 结论 敲低PHGDH可通过能量代谢抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、侵袭, 促进其凋亡, 并促进其成骨分化。     

干扰CD326可抑制VCaP细胞雄激素受体表达并降低细胞的增殖、侵袭及迁移能力

目的干涉前列腺癌细胞系VCaP细胞的CD326的表达,观察其对雄激素受体(AR)、前列腺特异性抗原(PSA)的表达以及前列腺癌细胞表型的影响,明确CD326与雄激素抵抗性前列腺癌发生之间的相关性。方法构建CD326短发夹RNA(CD326shRNA)稳定感染的VCaP细胞株。Western blot法检测稳定感染细胞株中AR及PSA的水平变化,ELISA检测VCaP细胞培养上清中的PSA分泌水平。MTT法检测细胞增殖、末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记法(TUNEL)和Alexa Fluor488标记的膜联素Ⅴ/碘化丙锭(annexinⅤ-Alexa Fluor488/PI)双染法检测细胞凋亡、细胞划痕实验检测细胞迁移、TranswellTM实验检测细胞侵袭能力。结果下调VCaP前列腺癌细胞株中CD326表达后,VCaP细胞中AR及PSA的表达水平显著降低,细胞上清中PSA的分泌水平也显著降低,同时伴随细胞增殖、抗凋亡、侵袭以及迁移能力的显著降低。结论下调VCaP细胞CD326水平可降低AR的表达,使前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力降低。