冻存复苏人脐带间充质干细胞体外扩增和向脂肪细胞分化的研究

目的：分离培养人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells hUCMSCs）,观察其冻存复苏后向脂肪细胞定向分化的能力。方法：将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,观察细胞生长及检测其表面抗原。将第1代的hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存5个月,复苏后培养至第12代时,加入成脂诱导剂培养。当诱导至21天时行油红O染色,7天及14天时用RT—PCR技术分别检测成脂转化基因过氧化物酶增殖剂受体（PPAR γ-2）和脂蛋白酯酶（LPL）。结果：组织块培养法收获的单个核细胞培养传代后,能获得均一贴壁的间充质干细胞,hUCMSCs冻存复苏后,活细胞约为86％,流式细胞仪分析这些细胞表达CDI3、CD44和CD71等MSCs标志物,不表达CD14、CD34和HLA—DR表面抗原。复苏细胞在成脂诱导剂的作用下,细胞中有脂滴产生,通过油红0染色显示细胞核周围有脂滴聚集,通过RT—PCR检测有LPL及PPARγ2 mRNA的表达。结论：采用组织块贴壁培养法分离获得的人脐带间充质干细胞可冷冻保存。复苏后培养至第12代仍具有向脂肪细胞分化的潜能,可作为脂肪组织工程种子细胞来源。     

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。     

犬骨髓间充质干细胞体外分离、诱导成纤维细胞的实验研究

目的探讨体外稳定诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为成肌纤维细胞和成纤维细胞的方法,为构建组织工程瓣膜提供种子细胞。方法应用Percoll(密度1·073g/ml)淋巴细胞分离液分离健康犬骨髓标本,取分离的BMSC,在低糖改良Eagles培养液中培养,并用免疫组织化学的方法做细胞表型鉴定,然后用条件培养基对第2、3代细胞进行诱导分化,并用层黏连蛋白单抗对诱导后的细胞做免疫组织化学鉴定。并对诱导后细胞进行冻存,7d后复苏观察细胞的生长、增殖及功能。结果经Percoll液分离的骨髓单核细胞,经贴壁培养后,其表型为波形蛋白阳性、α平滑肌肌动蛋白阳性、CD3-4、层黏连蛋白阴性;诱导后细胞表达层黏连蛋白,阳性细胞数可达(50±3)%;诱导后BMSC经冻存复苏后,细胞复苏率(85±3)%,复苏后细胞生长、增殖旺盛,功能不受影响。结论BMSC体外能定向诱导分化为成肌纤维细胞和成纤维细胞,并符合种子细胞的要求。     

不同代次小鼠脂肪干细胞增殖能力及体外成脂能力的实验研究

目的观察不同代次小鼠脂肪干细胞(mASCs)增殖能力及体外成脂能力,为组织工程种子细胞的合理选用提供实验依据。方法采用胶原酶消化小鼠腹股沟皮下脂肪组织,贴壁培养,体外传代扩增。实验采用原代(P0)、第2代(P2)和第5代(P5)细胞。观察不同代次mASCs的细胞形态及增殖能力;经高密度接种培养4周及成脂诱导2周,通过油红染色、RT-PCR检测,探讨其诱导成脂分化潜能及自发成脂能力。结果小鼠脂肪干细胞经传代后,外观主要呈长梭形及不规则形,不同代次的mASCs均具有很强的体外增殖能力;P0细胞具有极强的体外自发成脂能力,P2细胞自发成脂能力明显降低,至P5时基本没有体外自发成脂能力;P0、P2、P5细胞具有相似的诱导成脂分化潜能。结论随着培养代次的增加,mASCs自发成脂能力降低而诱导成脂分化潜能基本不变,扩增至第5代时仍维持了较强的增殖能力及良好的干细胞特性。在一定范围内mASCs体外传代扩增能明显减少其脂肪前体细胞的含量,有助于间充质干细胞纯化。     

不同冻存方法对大鼠脂肪来源干细胞生物学特性的影响

目的：研究不同冻存方法对脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells,ADSCs）生物学特性的影响。方法：体外分离培养SD大鼠腹股沟及附睾周围的脂肪组织，取第三代ADSCs冻存于液氮。实验分为三组：对照组A组为非冻存细胞，B组使用无血清非程序冻存液冻存细胞，C组使用传统冻存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）冻存细胞。12个月后复苏ADSCs，通过对比ADSCs的表面抗原、细胞凋亡、增殖及成骨分化情况，分析各组ADSCs生物学性能的差异。结果：各组细胞高表达CD29、CD90;A、B两组细胞的凋亡率显著低于C组（P<0.05）;B、C两组的增殖情况和A组相比，差异无统计学意义（P>0.05）,B组细胞的成骨分化能力要优于C组（P<0.05）。结论：无血清非程序冻存液冻存ADSCs的效果要优于传统冻存液。     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的:建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法:取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行VonKossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红O染色。结果:从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,VonKossa染色出现矿化结节;在IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论:成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便地保存,有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时,NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略,地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的：建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法，并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法：取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪，Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞，接种至含10％胎牛血清的DMEM培养液，培养并适时传代，每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征，测定其生长曲线，进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化，进行Von Kossa染色；使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化，进行油红O染色。结果：从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞，其在体外生长增殖迅速，呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强，可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下，表现出成骨细胞特性，Von Kossa染色出现矿化结节；在IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、吲哚美辛、胰岛素的诱导下，表现出脂肪细胞特性，油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后，其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论：成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法，获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛，具有多向分化能力，可以方便地保存，有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时，NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略，地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

冻存后大鼠睾丸组织精原干细胞的体外分离培养

目的 研究冻存的大鼠睾丸组织复苏后精原干细胞（SSCs）体外分离培养的生物学特性。方法 用二甲基亚砜（DMSO）作低温保护液，于液氮中冻存。4个月后复苏冻存的睾丸组织，进行SSCs的分离纯化，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层进行培养，并利用碱性磷酸酶（AKP）鉴定SSCs。结果 从冻存睾丸组织分离的精原干细胞在MEF饲养层上的正常形态、增殖能力与新分离的精原干细胞无明显不同。结论 大鼠睾丸组织的冷冻复苏并不影响精原干细胞其原有的生物学特性，包括其正常的贴壁、形态和增殖能力。     

蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞冻存复苏后生物学活性的影响

目的：研究体外条件下蜕皮甾酮（EDS）对冻存复苏后人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）生物学活性的影响。方法：hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存,6个月后复苏,扩增、传代,分3组培养：空白对照组用普通培养基培养;低剂量EDS组在普通培养基中加入100μg／mlEDS;高剂量EDS组在普通培养基中加入200μg／mlEDS。显微镜下观察细胞形态,10d时计算克隆形成能力,绘制细胞生长0～7d的细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定hucMscs的细胞表面特异标记（CD34、CD45、CD29、CD105）,油红0染色及茜素红染色观察huCMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。结果：两EDS组克隆形成率约为75％,空白对照组约为40％。生长曲线显示两EDS组增殖速度较空白对照组快,但两EDS组增殖速度相近。流式检测结果显示两EDS组的CD29、CD105阳性率明显高于空白对照组,CD34、CD45里阴性表达,其表达明显低于空白对照组（P〈0．05）,两EDS组之间差异无统计学意义;成骨、成脂分化能力检测发现,各组细胞均能够向脂肪细胞、成骨细胞分化,而高剂量EDS组细胞在未加诱导培养基的情况下仍出现向成骨细胞分化的趋势。结论：在一定浓度范围内,EDS对细胞复苏后恢复细胞活性以及提高存活率方面具有积极作用,但是较高浓度的EDS有诱导细胞向成骨细胞方向分化的趋势。     

低温冻存对胚胎大鼠神经干细胞生物学特性的影响

目的 研究不同冻存液对胚胎大鼠神经干细胞的保护作用及低温冻存对神经干细胞增殖及分化潜能的影响。方法 分别应用冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ对源于胚胎大鼠的神经干细胞球进行冷冻,于复苏后进行传代培养,并鉴定其增殖和分化能力。结果 复苏后的神经干细胞可以多次传代,冻存神经干细胞的克隆增殖率为(36.80±3.81)％,未冻存者为(38.15±4.80)％,两者相比差异无显著性(P>0.05)。冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ保存的神经干细胞分化为神经元的比例分别为(7.61±0.74)％和(12.76±2.53)％(P>0.05);分化为少突胶质细胞的比例分别为(0.90±0.50)％和(2.18±0.33)％(P>0.05);分化为星形细胞的比例为(47.67±2.10)％和(35.38±3.14)％(P<0.05)。结论 冻存的胚胎大鼠神经干细胞复苏后仍具有活跃的增殖和分化潜能,含10％血清的冻存液可以促使神经干细胞向星形细胞方向转化。     

骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞的分化潜能

目的：观察骨髓间充质干细胞在体外分化成淋巴管内皮细胞的可能性。方法：采用密度梯度离心法分离成人骨髓间充质干细胞,体外扩增,流式细胞术检测细胞表面标志。用内皮细胞培养基EGM-2培养,加入VEGF-C（156s）诱导后,相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测淋巴管内皮细胞特异性标志物Podoplanin和VEGFR-3,RT-PCR检测相应基因的表达。成管实验检测分化的淋巴管内皮细胞的功能。结果：分离培养的骨髓间充质细胞形态上为纤维样,经流式细胞术测定表达CD90、CD105,其阳性表达率分别为90.03%、97.86%,而CD14、CD34、HLA-DR的阳性阳性率分别为2.00%、2.18%、1.56%。经诱导刺激后,间充质干细胞呈鹅卵石样外观,Podoplanin和VEGFR-3的表达率分别为26.25%和12.70%。RT-PCR结果显示特异性的条带,成管实验显示诱导后的淋巴管内皮细胞具有成管的功能。结论：从骨髓中可以提取到骨髓间充质干细胞,在内皮细胞培养基和VEGF-C（156s）的诱导下骨髓间充质干细胞可以分化为淋巴管内皮细胞。     

人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中白蛋白的表达研究

目的观察在体外诱导人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中自蛋白的表达特征。方法从手术切除弃置的人肋骨骨髓中分离基质细胞,在含有肝细胞生长因子(HGF)、淋巴细胞抑制因子(UF)、纤维母细胞生长因子(FGF)等条件培养基中培养细胞。应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察肝细胞特异性白蛋白染色;同时,于诱导培养后多时间点测定培养细胞产生的白蛋白水平。结果人骨髓来源的基质干细胞在条件培养基中经诱导后,分化为成熟附壁细胞;细胞胞浆内肝细胞特异性标志物白蛋白呈阳性染色;已分化细胞合成并分泌白蛋白,其表达水平随细胞分化显示时间依赖性变化特征。结论人骨髓基质干细胞经诱导培养后可向成熟肝细胞分化并具有合成和分泌白蛋白功能,可以作为临床肝细胞移植及生物人工肝等治疗终末期肝病的重要肝细胞来源。     

肝细胞极化标志分子在骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中的表达

目的观察在体外诱导成人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞极化标志分子的表达和分布。方法从成人骨髓中分离基质干细胞，在体外诱导分化为成熟肝细胞。应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法比较肝细胞极化标志蛋白二肽酰基肽酶Ⅳ（DPPIV）和低密度脂蛋白受体（LDLr）mRNA在诱导分化（实验组）和非诱导分化（对照组）条件下的表达情况。应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察DPPIV和LDLr在细胞膜上的分布情况。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导后分化表达白蛋白，实验组DPPIV和LDLr mRNA的表达高于对照组（P〈0．05）。DPPIV和LDLr在肝细胞膜上呈特征性分布。结论成人骨髓基质干细胞在向肝细胞分化过程中表达肝细胞极化标志分子，进一步表明骨髓基质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。同时，肝细胞体外分化可以做为研究肝细胞极化形成机制的良好模型。     

痩素在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化早期的作用研究

目的 研究小鼠骨髓基质干细胞体外增生及向成骨细胞定向分化早期瘦素(Leptin)的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，在传代细胞培养时加入Leptln(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，分别检测两组的细胞增生情况。半定量RT-PCR方法检测成骨细胞相关基因Cbfal和Cbtb等在两组细胞分化过程中的表达。结果 实验组在细胞培养24和48h细胞数量明显少于对照组，显示时间与Leptin剂量依赖特性。Leptln在传代细胞培养中促进成骨细胞特异性转录因子Cbfal和Cbtb的表达。结论 Leptin抑制骨髓基质干细胞体外增生并促进早期成骨细胞相关基因的表达。     

地塞米松对骨髓基质干细胞体外增殖的影响

目的 观察地塞米松对小鼠骨髓基质干细胞体外增殖的作用。方法 取雄性6周龄ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行体外培养，在细胞培养不同时间点加入10^-8mol／L地塞米松（实验组）或保持基础培养条件（对照组），用CellTiter方法分别检测两组的细胞增殖情况，并予比较。结果 在细胞培养不同阶段开始应用地塞米松的实验组中，细胞增殖能力较对照组降低，随着培养时间延长实验组细胞数量明显少于对照组。实验组中细胞形态较对照组更趋成熟。结论 地塞米松在促进骨髓干细胞定向分化早期抑制骨髓基质干细胞体外增殖。     

细胞因子在诱导多能干细胞向肝细胞分化作用中的研究进展

诱导多能干细胞揭开了一个干细胞研究的新途径,诱导多能干细胞可以在体外逐步分化为肝细胞,这一突破性地进展使得诱导多能干细胞成为了一个有前途的临床应用来源.在诱导多能干细胞向肝细胞分化的过程中,多种细胞因子通过协调各种肝细胞发育信号调控基因表达,促进诱导多能干细胞向肝细胞方向分化和成熟,本文就诱导多能干细胞向肝细胞分化过程中的相关细胞因子及其作用进行综述.     

人脐血间充质干/祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究

目的　了解脐血间充质干 /祖细胞用于心肌细胞再生的可行性 ,并探讨其最佳的诱导培养条件。方法　将脐血单个核细胞置于低血清 (2 % )DMEM培养基中生成贴壁细胞层 ,依传代方法 ,用相同培养条件进行扩增 ,扩增后的贴壁细胞置入心肌诱导培养液中 ,并添加 5 氮杂胞苷进行诱导分化、采用心肌特异性收缩蛋白 肌钙蛋白T染色鉴定被诱生的心肌样细胞。结果　脐血间充质干 /祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为 0 .5× 10 -6,在传 2 0代时 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍 ,诱导后 ,70 %的脐血间充质干 /祖细胞分化为心肌样细胞。结论　采用上述扩增与诱导条件 ,脐血间充质干 /祖细胞可得到有效扩增 ,并可高效向心肌样细胞分化。     

辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用

目的 通过对小鼠骨髓干细胞体外培养的观察，研究辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞定向分化过程中的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，应用组织化学及yon Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶染色和细胞外基质矿化；在细胞培养早期加入辛伐他汀(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，应用半定量RT-PCR方法分别检测两组Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、碱性磷酸酶(ALP)、转录因子CBFA1和Osterix(OSX)在成骨细胞分化过程中的表达。结果 小鼠骨髓基质细胞经体外诱导后分化为具备碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质的成熟成骨细胞。实验组COL1、ALP和CBFA1表达在细胞培养第3，5天均高于对照组，OSX表达差异不明显。结论 辛伐他汀在成骨细胞分化过程中促进其相关基因的表达。     

小鼠骨髓干细胞向肝细胞转化的体外实验研究

目的建立以30 ng/ml FGF-4和30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,研究体外骨髓干细胞向肝细胞的转化过程中细胞形态、结构、功能的变化.方法建立以30ng/ml FGF,30ng/mlOSM为主的小鼠骨髓干细胞诱导培养体系.观察细胞形态和数量的变化;RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测肝细胞特异性标记物的表达;通过PAS糖原染色、白蛋白ELISA、尿素合成试验,检测细胞的合成和代谢功能.结果诱导12 d,观察到多极性的肝细胞样细胞,且逐渐增多、集落不断增大.在诱导过程中,不同的时间点可以分别检测到HNF-3βmRNA、ALBmRNA、CK18mRNA、TTRmRNA、G6-PasemRNA和TATmRNA的表达.诱导21 d,细胞表达HNF-3β、ALB、CK18蛋白;免疫荧光定位示ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆.诱导21 d,细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒;在诱导过程中,不同的时间点检测到细胞分泌ALB、合成尿素的量的变化.结论我们建立的以30ng/ml FGF、30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,可以有效地促进骨髓干细胞体外定向转化为肝细胞.     

TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：研究TGF-β对成骨细胞增殖和分化的影响。方法：利用已建立的胎兔颅骨成骨样细胞体外模型，采用MTT法、流式细胞仪检测、骨钙素、胶原和钙含量测定来分析不同浓度的TGF-β对成骨样细胞增殖和分化的影响。结果：低浓度TGF-β（0.010.1ng/ml）促进成骨样细胞增殖，使S期细胞增加，但高浓度TGF-β（110ng/ml）抑制成骨样细胞的增殖。在TGF-β0.01-1ng/ml范围内，与对照组相比，TGF-β各治疗组的骨钙素、胶原和钙含量明显增加，并随TGF-β浓度增加而增加，到TGF-β10ng/ml时，增加不再明显。结论：TGF-β对成骨细胞的增殖表现为双相作用，低浓度促进，高浓度时抑制，可明显促进成骨细胞的分化，并呈一定的量效关系，其有效剂量为0.011ng/ml。