MRTF-A参与一氧化氮诱导的乳腺癌迁移相关基因表达

为研究NO对乳腺癌细胞迁移能力的影响及其分子机制,本研究首先用梯度浓度NO供体SNP处理乳腺癌细胞MCF-7,MTT法检测细胞活性,发现高浓度SNP抑制细胞增殖;PI-AnnexinV和Hoechst细胞核染色检测结果显示,高浓度NO促进细胞凋亡.用低浓度SNP处理细胞,划痕愈合及小室迁移实验结果显示,低浓度SNP促进细胞迁移;RT-qPCR和Westernblot结果显示,低浓度SNP上调转录调控辅因子MRTF-A及其下游的迁移相关基因MYL9、MYH9和CYR61的表达.在MCF-7细胞敲低NOS2基因同样导致MRTF-A、MYL9、MYH9及CYR61表达下降;敲低MRTF-A则SNP不再促进上述迁移相关基因的表达.以上实验结果提示:NO的肿瘤生物学效应与NO浓度密切相关,细胞内源性或外源性低浓度NO可能通过刺激迁移相关基因表达而促进乳腺癌细胞转移,而MRTF-A参与了NO诱导的迁移相关基因表达.     

miR-193b通过负向调控MCT7基因的表达抑制人胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭

为探讨miR-193b对人胶质瘤U251细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用HiPerFect转染试剂瞬时转染miR-193b模拟物(mimics)上调U251细胞中miR-193b的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率,然后进行细胞划痕实验及侵袭实验,分别检测miR-193b对U251细胞迁移及侵袭能力的影响.结果显示过表达miR-193b可抑制U251细胞迁移和侵袭的能力.应用生物信息学软件预测,提示单羧酸转运蛋白7(MCT7)基因可能是miR-193b的潜在靶基因.进而构建双荧光素酶报告基因系统从转录水平上证明MCT7为miR-193b调控的靶基因;qRT-PCR及蛋白质免疫印记(Western blot)分别在mRNA和蛋白水平上进一步证明MCT7基因的表达受miR-193b的负调控.由此可见,miR-193b很可能通过负向调控MCT7基因的表达来抑制U251细胞的迁移与侵袭.     

rPA(K)的定点突变及其真核表达载体在COS-7细胞中的瞬时表达

采用定点突变技术,对真核表达载体pCSRK上的目的片段rPA(K)进行突变,获得了含有突变体rPA(KN)(N184→Q)的真核表达载体pCSRKN.酶切和测序结果证明,成功去除了184位的糖基化位点.用LipofectamineTM2000 Reagent将pCSRKN转染至COS-7细胞,取转染后不同培养时间上清,以FAPA法进行检测.结果表明,表达产物具有良好的溶圈活性,从而验证了pCSRKN在真核系统表达的可行性.     

长链非编码RNA HAGLROS对非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨长链非编码RNA HAGLROS(lncRNA HAGLROS)对非小细胞肺癌A549细胞系迁移和侵袭能力的影响.方法采用siRNA(小RNA干扰技术)对细胞进行转染;同时采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测相关目的基因的表达水平;应用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力;应用Transwell实验检测细胞的侵袭能力.结果 qPCR结果显示:对A459细胞进行转染后,siRNA-lncRNA HAGLROS-homo-435敲减效率最高,差异具有统计学意义(P0.05);划痕实验和Transwell实验结果表明:实验组与对照组比较,细胞迁移能力、细胞侵袭能力均下降,差异具有统计学意义(P0.05).结论 lncRNA HAGLROS在肺癌细胞系A549中作为促癌基因发挥作用,可为肺癌的诊断及治疗提供临床参考.     

HDAC抑制剂SAHA抑制人乳腺癌细胞MCF-7的迁移和增殖

用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase complex,HDAC)抑制剂SAHA对人乳腺癌细胞MCF-7进行处理,抑制组蛋白的去乙酰化,进而检测SAHA对MCF-7的影响.体外划痕实验与Transwell实验表明SAHA可以抑制MCF-7细胞的迁移;免疫印迹(Western blot)实验表明SAHA可以抑制迁移相关基因MYL9蛋白水平的表达.MTT实验和克隆形成实验表明SAHA可以抑制MCF-7细胞的增殖;Western blot实验与逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验表明SAHA能够抑制细胞周期蛋白标志基因CyclinD1、CDK4的表达,促进周期蛋白激酶抑制剂p21的表达.     

黄连素通过诱导肿瘤细胞内GRP78膜转位而促其凋亡

通过MTT实验发现,黄连素对结肠癌细胞HCT-116和乳腺癌细胞MCF-7的增殖有明显的抑制作用。Western blotting和实时定量PCR结果显示,经黄连素处理后,肿瘤细胞中凋亡相关蛋白Caspase12和CHOP在转录和翻译水平均明显上调。进一步研究发现,黄连素处理使得内置网分子伴侣蛋白GRP78在表达量不变的情况下,发生了明显的细胞膜转位。利用相应抗体封堵细胞膜上GRP78后,黄连素诱导的细胞凋亡明显缓解,表明肿瘤细胞表面GRP78介导了黄连素诱导的肿瘤细胞凋亡。     

野生型人DNA polβ高表达中国仓鼠卵巢细胞系的建立及其生物学特征

脂质体转染法将野生型人DNA聚合酶beta(polβ)重组绿色荧光蛋白表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞系(CHO),经G418筛选得到稳定高表达人野生型polβ的CHO细胞.通过RT-PCR方法检测转染细胞polβmRNA的表达水平,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂实验测细胞恶性增殖能力,6-TG实验测细胞自发突变率,以探讨转染细胞的生物学特性.结果显示,转染细胞polβ的mRNA的表达较空载体转染细胞、对照细胞增加,细胞周期多被阻滞在S期,细胞软琼脂集落形成率增高,自发突变率增加,表明polβ的过表达与细胞周期的分布、细胞恶性增殖程度、遗传稳定性相关.     

Apelin-13通过ERK_(1/2)信号通路促进MCF-7细胞的增殖及侵袭

采用MTT、Brdu流式细胞术,Transwell侵袭实验,ElISA、Western blot检测实验研究了apelin-13对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭的影响.结果表明:apelin-13能够激活ERK1/2信号传导通路,上调Cyclin D1和MMP-1的表达,进而促进MCF-7细胞的增殖及侵袭,可为临床乳腺癌的诊断、防治及愈后评估提供新的思路和方法.     

腺病毒介导的TRF2 RNAi表达载体诱导MCF-7细胞凋亡的研究

选择针对人TRF2 mRNA的特异性siRNA靶序列,设计、合成其相应的双链DNA,并构建成表达siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2,转染人乳腺癌MCF-7细胞,以Western印迹法检测MCF-7细胞TRF2蛋白表达、MTT比色法绘制MCF-7细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞凋亡情况.实验结果表明:重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2构建成功,转染MCF-7细胞后可明显抑制TRF2基因的表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡.说明通过RNAi技术抑制TRF2基因表达,进而诱导肿瘤细胞凋亡可能用于肿瘤的基因治疗.     

p38α半胱氨酸点突变体真核表达载体的构建和表达

以pFLAG-CMV-5.1-p38α为模板,应用PCR定点突变技术将p38α的第39、119、162和211位半胱氨酸(Cys)点突变体定点突变为丙氨酸(Ala)(C39A、C119A、C162A、C211A),使用琼脂糖凝胶电泳及基因测序检测其结果;并采用脂质体转染法将p38α的野生型和突变体质粒分别转入HEK293细胞,免疫印迹鉴定野生型及其突变体p38蛋白表达。结果显示,构建的C39ApFLAG-CMV-5.1、C119ApFLAGCMV-5.1、C162ApFLAG-CMV-5.1和C211ApFLAG-CMV-5.1重组载体成功点突变,并在HEK293细胞中高效表达,为深入研究p38在缺血性脑损伤中的作用及机制打下基础。     

过表达maspin对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

通过构建maspin表达质粒,在人乳腺癌MCF-7细胞中过表达maspin,研究maspin对MCF-7细胞增殖率及凋亡率的影响.MTT检测实验表明,过表达maspin能够剂量依赖性抑制MCF-7细胞的增殖率.采用TUNEL法和流式细胞术检测maspin对MCF-7细胞凋亡的影响,结果表明过表达maspin可促进MCF-7细胞凋亡进而抑制其增殖.     

CKLF1过表达对肾癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响及机制研究

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤.趋化素样因子1(chemokine-like factor 1, CKLF1)在多种恶性肿瘤中呈高表达,本研究旨在探讨CKLF1在肾癌细胞ACHN中过表达后,肾癌细胞ACHN增殖、迁移和侵袭能力的变化及其发生机制.利用4D核转染技术将实验组和对照组质粒分别转染肾癌ACHN细胞,实现该因子在肾癌细胞中的过表达.显微镜下,通过观察绿色荧光蛋白在视野细胞中的表达比例判定转染效率.利用Incu Cyte S3活细胞动态成像与分析系统评估细胞的增殖情况.划痕和transwell实验被用于评估CKLF1过表达后,肾癌细胞迁移和侵袭能力的变化情况.Western blot法检测CKLF1过表达后,蛋白CyclinD1、MMP2表达情况.动态细胞监测系统检测结果显示,与对照组相比较,实验组细胞的增殖活性明显高于对照组.CKLF1过表达后,实验组肾癌细胞的迁移和侵袭能力均明显升高,并且CyclinD1和MMP2蛋白表达水平明显高于对照组.CKLF1可能通过促进CyclinD1的表达增强细胞的增殖活性，通过促进MMP2蛋白的表达,增强ACHN细胞的迁移和侵袭能力.在肾癌的发生...     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶突变体MEKK3~(KI)的构建及功能鉴定

有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)家族,其在细胞增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤的发生中发挥了重要的作用。利用分子克隆手段构建激酶功能失活(kinase inactive)型突变体MEKK3KI(391位赖氨酸突变为甲硫氨酸,K391→M391)的真核表达载体,并通过检测MEKK3KI蛋白对NudC的磷酸化作用及对细胞周期的影响以鉴定其生物活性。根据GenBank提供的人源MEKK3的cNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3(MEKK3~(WT))的目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增激酶功能失活型MEKK3KI目的基因,并将其分别克隆至带有FLAG标签的真核表达载体p CMV-tag-2c和带有GFP标签的真核表达载体pEGFP-C1中。DNA序列分析结果显示,MEKK3KI基因序列成功将391位点的赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M),表明突变体构建成功;免疫印迹分析显示,MEKK3~(WT)、MEKK3KI重组体均在He La细胞中高效表达;体外模拟磷酸化实验结果显示,野生型MEKK3~(WT)在体外可以磷酸化NudC,而激酶功能失活型突变体MEKK3KI无法将其磷酸化;激光共聚焦显微镜观察发现,野生型MEKK3在HeLa细胞中过表达,细胞核形态异常,与凋亡细胞核形态相似,而失活型MEKK3过表达不会导致细胞核明显变化。总之,本实验成功构建了野生型、失活型MEKK3的真核表达载体,同时发现其可以磷酸化NudC,促进细胞凋亡,为进一步揭示MEKK3生物学功能奠定了基础。     

Jab1基因的RNAi对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的影响

为探讨Jab1基因在乳腺癌细胞中的生物学功能,进一步揭示其作用的分子机制.首先在乳腺癌细胞MCF-7中,成功建立了慢病毒介导的Jab1基因的RNAi系统,并通过CCK8细胞增殖实验和细胞划痕实验证实Jab1基因表达的干扰使得MCF-7细胞的增殖和迁移发生显著的下降,细胞周期分析表明,干扰Jab1的表达能增加MCF-7细胞sub G1期的比例,诱导凋亡;此外,通过RT-PCR和Western blot实验首次发现Jab1能调控TBHS1的表达,添加甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC能抑制Jab1表达干扰介导的THBS1表达下调,提示Jab1可通过甲基化的表观遗传学途径调控THBS1基因的表达.     

PinX1基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用

探讨了PinX1 基因在乳腺癌MCF-7 细胞生长和细胞周期中的作用, 初步探讨了该基因用于乳腺癌临床治疗的可行性. 采用RT-PCR 技术从293-T 细胞中扩增PinX1 基因, 将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1 中, 再将重组质粒转染MCF-7 细胞. 通过real-time PCR 检测PinX1 基因的mRNA 表达, 用MTT 法检测转染前后细胞生长曲线的变化, 用流式细胞仪检测转染目的基因后细胞生长周期的改变. 检测结果表明, PinX1 基因已经在转染后MCF-7 细胞的细胞核内稳定表达, 乳腺癌细胞生长明显减缓(P <0.05), 增殖变慢(P <0.05), 细胞生长阻滞于G0/G1 期, 说明PinX1 基因可抑制乳腺癌MCF-7 细胞的生长和增殖.     

Spindlin 1编码的蛋白质定位于细胞核并使NIH3T3细胞发生恶性转化

研究了卵巢癌中高表达的新基因spindlin1的亚细胞定位及其对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响, 并探讨了人spindlin1基因的生物学功能. 采用脂质体转染法将构建的融合蛋白表达载体pEGFP-N1/ pEGFP-N1-spindlin1瞬时转染COS-7细胞,观察spindlin1基因的亚细胞定位;同时稳定转染NIH3T3细胞,经G418抗性筛选后,用RT-PCR筛选并鉴定表达spindlin1的稳定细胞株;通过细胞增殖活性、流式细胞检测、软琼脂克隆形成、迁移实验及裸鼠成瘤等对转染细胞的生物学行为进行检测. 结果表明,spindlin1定位于胞核;并促进NIH3T3细胞的增殖,使其处于G2/M期的细胞比例显著增加;同时证实过表达spindlin1的NIH3T3细胞不仅具明显的克隆形成及迁移能力,而且能使裸鼠成瘤. 由此我们得出结论:spindlin1基因过表达可促使NIH3T3细胞发生恶性转化,提示spindlin1可能是一种与肿瘤形成相关的原癌基因.     

Rho信号通路抑制剂Y27632抑制TGF-β诱导的MCF-7细胞上皮间质转化

许多研究表明在乳腺癌的发生过程中上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)起到十分重要的作用,转化生长因子–β(transforming growth factor-β,TGF-β)是公认的可以引起EMT的重要因子,在EMT过程中涉及许多信号通路,但是Rho信号通路在其中的作用尚未报道.本文首先建立TGF-β诱导人乳腺癌细胞MCF-7上皮间质转化的模型,利用划痕实验检测细胞迁移能力,利用实时定量荧光PCR(real-time PCR)和免疫印迹(Western blot)实验检测间质标志基因的表达情况.进一步通过加入Rho通路抑制剂Y27632研究Rho通路在TGF-β诱导的MCF-7细胞EMT中的作用,结果证实TGF-β可以诱导MCF-7细胞EMT,促进MCF-7细胞迁移,而Y27632抑制TGF-β诱导的MCF-7细胞EMT过程及其迁移.     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7活性的作用及影响

目的 探讨端粒酶特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性、增殖和凋亡的影响.方法 设计合成RZ基因,构建人端粒酶锤头状核酶真核表达质粒pcDNA3.1( )-hTERT-RZ,测序鉴定.提取MCF-7细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因的cDNA片段,插入载体pMD18-T并测序鉴定.将核酶重组体及hTERT载体体外转录,琼脂糖凝胶电泳检测Rz的切割活性.核酶载体转染乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR法检测核酶重组子转染效率及核酶转染细胞中hTERT mRNA的表达量,TRAP法测定细胞端粒酶活性,MTT法、流式细胞仪测定细胞增殖及凋亡.结果 测序表明peDNA3.1( )-hTERT-Rz和pMD18-T-hTERT构建成功.5%琼脂糖凝胶电泳表明体外转录出Rz和靶基因hTERT,Rz对靶基因hTERT具有切割活性.构建好的核酶真核表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞.发现其潜伏期延长,对数生长期减缓,S期细胞比例降低,G1期细胞比例增高(P＜0.01).端粒酶活性检测发现端粒酶活性明显降低.结论 端粒酶催化亚单位特异性核酶对靶基因hTERT在体外和体内均有催化切割活性,该核酶在乳腺癌MCF-7细胞中抑制hTERT的表达和细胞增殖,为核酶应用于恶性肿瘤的基因治疗提供了实验依据和新型工具酶.     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶突变体MEKK3的构建及功能鉴定

有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase 3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于MAP3K(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase)家族,其在细胞增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤的发生中发挥了重要的作用。本文利用分子克隆手段构建激酶功能失活(kinase inactive)型突变体MEKK3KI(391位赖氨酸突变为甲硫氨酸,K391→M391)的真核表达载体,并通过检测MEKK3KI对NudC的磷酸化作用及对细胞周期的影响以鉴定其激酶活性。根据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3(MEKK3WT)的目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增激酶功能失活型MEKK3KI目的基因,并将其分别克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c和带有GFP标签的真核表达载体pEGFP-C1中。DNA序列分析结果显示,MEKK3KI基因序列成功将391位点的赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M),表明突变体构建成功;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3KI重组体均在HeLa细胞中高效表达;体外模拟磷酸化实验结果显示,野生型MEKK3WT在体外可以磷酸化NudC,而激酶功能失活型突变体MEKK3KI无法将其磷酸化;激光共聚焦显微镜观察发现,野生型MEKK3转染HeLa细胞,细胞核形态异常,与凋亡细胞核形态相似,而失活型MEKK3过量表达不会导致细胞核明显变化。总之,本实验成功构建了野生型、失活型MEKK3的真核表达载体,为进一步揭示MEKK3生物学功能奠定了基础。