辣椒素抑制大鼠肝纤维化的实验研究

 目的：探讨辣椒素（capsaicin）对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）活性的影响及其对实验性肝纤维化的治疗作用。方法：DCFH-DA法检测辣椒素对HSCs中活性氧的影响;CCK-8法检测辣椒素对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs α-平滑肌肌动蛋白的表达;RT-PCR检测辣椒素对HSCs纤维化相关基因表达的影响;流式细胞术检测辣椒素对HSCs凋亡的影响;通过腹腔注射四氯化碳建立鼠肝纤维化模型,经腹腔输注辣椒素,检测肝组织病理切片,观察肝纤维化指标的变化。结果：与对照组比较,辣椒素抑制了HSCs中活性氧的产生,明显抑制了HSCs的活化与增殖(P<0.05),促进了HSCs的凋亡(P<0.05),降低了金属蛋白酶组织抑制物1及转化生长因子β 1的表达(P<0.05),降低了肝羟脯氨酸含量及血清Ⅲ型胶原和透明质酸水平(P<005)。结论：辣椒素抑制HSCs增殖、活化并诱导其凋亡。辣椒素对实验性肝纤维化具有一定的抑制作用。     

脑源性神经营养因子对细胞外蛋白水解酶激活作用的研究

 目的：研究脑源性神经营养因子 (BDNF) 对细胞外蛋白水解酶表达和激活作用的影响。 方法：体外分离并培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），RT-PCR法检测HUVEC基质金属蛋白酶MMP-2 、MMP-9 和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达，明胶酶谱检测MMP-2和MMP-9蛋白酶活性，纤维蛋白酶谱检测尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）蛋白酶活性，Western blotting检测uPA、纤溶酶原激活剂抑制剂（PAI）、TIMP-1及TIMP-2表达。 结果：在对HUVEC增殖无明显促进作用的浓度范围内，BDNF可促进无血清培养的HUVEC MMP-2和MMP-9 mRNA表达,并可促进MMP-2和MMP-9酶原的激活产生活性明胶酶，BDNF对TIMP-1和TIMP-2的表达无明显影响。BDNF以浓度和时间依赖性方式上调HUVEC uPA和PAI-1的表达，并可促进uPA的活性。 结论：BDNF可激活MMPs和uPA/PAI相关的蛋白级联。     

氧化苦参碱抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化及其机制研究

 目的：探讨氧化苦参碱(OM)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用及其可能机制。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK52E细胞,随机分为：对照组、高糖组、高糖+OM不同浓度组和高糖+0.50 g/L OM动态观察组。采用real-time PCR和Western blotting方法检测转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）mRNA和蛋白的表达。结果：（1）与对照组相比,高糖组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均进行性增高,Smad7蛋白表达进行性降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达进行性降低,呈时间依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达进行性增高（P＜0.05）;（2）与高糖组相比,高糖+ OM不同浓度组随OM剂量增加,TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达均逐渐降低,Smad7蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,且呈剂量依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异;（3）与高糖组相比,高糖+0.50 g/L OM动态观察组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达持续降低,Smad7蛋白表达持续增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达持续增高（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异。结论：OM可抑制高糖诱导的NRK52E细胞发生EMT,其机制可能与OM下调TGF-β1表达及上调Smad7蛋白表达,进而抑制TGF-β1/Smads信号通路的致纤维化效应有关。     

全反式维甲酸对人胚肺成纤维细胞增殖及α-SMA表达的影响

目的: 研究全反式维甲酸(ATRA)对人胚肺成纤维细胞(HFL-I)增殖与分化的影响。方法: 体外培养HFL-I, MTT法检测不同浓度ATRA(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)作用3 d对HFL-I增殖能力的影响。5 μg/L 转化生长因子β₁(TGF-β₁)刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA表达,刺激0 d、1 d、3 d、5 d后,Western blotting法检测α-SMA蛋白表达。不同浓度ATRA干预,24 h后RT-PCR方法检测α-SMA mRNA表达,3 d后用Western blotting方法检测α-SMA蛋白表达。结果: (1) MTT法检测显示不同浓度ATRA以浓度依赖性方式抑制HFL-I细胞的增殖(P<0.05)。(2)5 μg/L TGF-β₁诱导后,HFL-I细胞中α-SMA mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。(3) ATRA以浓度依赖性方式下调TGF-β₁诱导的α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论: ATRA能够抑制HFL-I细胞的增殖和TGF-β₁诱导的分化,该作用可能是通过下调α-SMA mRNA和蛋白的表达实现的。     

支架蛋白活化蛋白激酶C受体1在胃癌细胞中的表达及其与胃癌细胞增殖的关系

目的 探讨活化蛋白激酶C受体1C(RACK1, GNB2L1)在胃癌细胞HGC27中的表达及过表达RACK1对HGC27生长增殖的影响。方法 体外培养胃癌未分化细胞HGC27和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1,收集细胞48 h后,提取mRNA和蛋白,利用RT-PCR检测RACK1 mRNA在HGC27和GES-1细胞中的表达;利用Western blotting法检测RACK1蛋白在两种细胞中的表达;以人胚肾HEK293细胞cDNA为模板,构建pcDNA3.1A-flag-RACK1重组质粒,利用Lipo2000转染入HGC27细胞中,Western blotting法检测质粒的转染效率,MTT法检测过表达RACK1对HGC27胃癌细胞系生长增殖的影响。 结果 HGC27胃癌细胞中RACK1的mRNA和蛋白水平表达低于GES-1细胞（P<0.01）。双酶切鉴定和测序分析表明,pcDNA3.1A-flag-RACK1重组质粒构建成功。将该质粒转入HGC27细胞后,与未转染组相比,空载转染组RACK1蛋白表达无明显区别（P>0.05）,pcDNA3.1-RACK1转染组RACK1蛋白表达明显升高（P<0.01）;转染pcDNA3.1A-flag-RACK1转染组细胞存活率在72 h和96 h明显少于pcDNA3.1空载对照组（P<0.01）。结论 支架蛋白RACK1的mRNA和蛋白水平在HGC27细胞中低表达,上调RACK1的表达可明显抑制HGC27细胞增殖。     

PLGF参与Ang II诱导的心脏成纤维细胞激活

 目的：探讨胎盘生长因子（PLGF）在血管紧张素II（Ang II）激活心脏成纤维细胞(CFs)中的表达及其作用。方法：原代分离培养并鉴定新生SD大鼠CFs。蛋白免疫印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、PLGF和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2),免疫荧光观察α-SMA的表达,WST-1法检测细胞增殖,RT-PCR检测PLGF、I型和III型胶原蛋白的mRNA表达水平。结果：(1)Ang II组PLGF mRNA 表达明显高于对照组（P<0．01),联用替米沙坦后,PLGF mRNA表达水平下降;Ang  II组PLGF蛋白表达水平高于对照组（P<0.05); (2)PLGF诱导CFs增殖及α-SMA蛋白表达增加（P<0.05）;PLGF干预CFs 60 min后,p-ERK1/2蛋白水平表达明显高于对照组（P<0.01);(3)Ang II+anti-PLGF组与Ang II组比较,细胞增殖和α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,I型和III型胶原蛋白mRNA表达水平亦下调（P<0.05）。结论：PLGF可能参与Ang II诱导的CFs增殖和纤维化过程。     

丹参单体IH764-3促进H2O2刺激的鼠肝星状细胞胶原降解

目的观察丹参单体IH764-3对鼠肝星状细胞株(HSCs)基质金属蛋白酶-13(MMP-13)及其组织抑制因子(TIMP-1)表达的影响。方法应用体外细胞培养技术,用RT-PCR检测HSCsMMP-13mRNA水平;原位杂交和Westernblotting技术分别检测上述细胞TIMP-1mRNA和蛋白水平。结果IH764-3干预2h组MMP-13mRNA的表达强度明显上调,同时TIMP-1mRNA表达受抑制;IH764-3干预24h组TIMP-1蛋白表达受抑制。结论丹参单体IH764-3诱导HSCsMMP-13表达,抑制其TIMP-1表达是其抗肝纤维化的作用机制之一。     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

高氧、维甲酸对早产大鼠肺成纤维细胞MMP-2及TIMP-2表达的调控

目的:探讨维甲酸（RA）对高氧暴露下早产大鼠肺成纤维细胞（LFs）基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及其特异性组织抑制物-2（TIMP-2）表达的影响。方法:建立原代培养的早产大鼠LFs高氧暴露模型,采用半定量RT-PCR方法检测MMP-2和TIMP-2 mRNA表达,明胶酶谱法检测MMP-2酶原和活酶表达, Western blotting检测其磷酸化和总的ERK1/2、JNK1/2、p38和c-Jun表达。结果:（1）与对照组比较,高氧可促进早产大鼠LFs MMP-2 mRNA及其酶原和活酶表达（P<0.05,P<0.01）,同时使其p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-p38和p-c-Jun表达水平显著提高（P<0.01,P<0.05）;（2）RA能不同程度下调高氧诱导的早产大鼠LFs MMP-2 mRNA高表达和明显降低其p-JNK1/2、 p-p38和p-c-Jun表达（P<0.01,P<0.05）,但进一步提高p-ERK1/2表达;（3）高氧、RA对TIMP-2 mRNA和总ERK1/2、JNK1/2 、p38及c-Jun表达无明显影响。结论:高氧暴露通过激活MAPKs信号转导通路（主要是JNK和p38）使c-Jun磷酸化水平提高,促进MMP-2表达和激活;RA通过抑制JNK和p38磷酸化,下调MMP-2表达与活化,从而拮抗高氧诱导的肺损伤。     

沉默HIF-1α基因表达对大鼠肝癌细胞增殖的影响

 目的： 探讨沉默缺氧诱导因子　1α（HIF-1α）基因表达对缺氧状态下肝癌细胞增殖的影响。方法：选用大鼠CBRH-7919肝癌细胞株作为研究对象,利用氯化钴（CoCl2）建立缺氧模型。制备3组特异性较强的HIF-1α siRNA-脂质体复合物,转染于肝癌细胞。利用real-time RT-PCR、Western blotting等方法分别检测肝癌细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、p21和cyclin D1在mRNA和（或）蛋白水平的表达。MTT及BrdU 掺入实验检测细胞增殖的变化。结果：缺氧条件下,肝癌细胞的HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达显著增多（P<0.05）。HIF-1α基因表达沉默后,HIF-1α、VEGF及cyclin D1 mRNA和（或）蛋白表达明显减少（P<0.05）,p21蛋白表达明显增加（P<0.05）。HIF-1α siRNA转染组的BrdU阳性细胞比例明显少于对照组(P<0.05)。结论：沉默HIF-1α基因表达对缺氧状态下肝癌细胞的增殖有显著抑制作用。     

氯喹对体外活化肝星状细胞自噬与胶原代谢的影响

目的:研究不同浓度的自噬抑制剂氯喹(CQ)对活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响及可能机制。方法:应用转化生长因子β1(TGF-β1)活化HSC-T6细胞,给予CQ干预24 h。实验分组为:control组、TGF-β1组、TGF-β1+CQ(15μmol/L)组、TGF-β1+CQ(30μmol/L)组和TGF-β1+CQ(60μmol/L)组。采用Western blot技术检测微管相关蛋白轻链3(LC3)比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬靶蛋白P62、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)和TIMP-2的表达情况;免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;RT-q PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2mRNA的表达变化。结果:CQ干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高且呈剂量依赖性;P62蛋白表达TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组(P0.01)。TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较control组显著增加,TGF-β1+CQ组较TGF-β1组也有明显增加。α-SMA的表达在TGF-β1组和TGF-β1+CQ组均显著高于control组(P0.05),而TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间无显著差异。MMP-13表达在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降(P0.05);TIMP-1和TIMP-2在TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著升高(P0.05),且呈剂量依赖性。结论:自噬抑制剂CQ能显著增加HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依赖性,这可能与其上调TIMP-1及TIMP-2的表达并抑制MMP-13表达有关。     

白细胞介素-34/集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的表达

目的探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体(IL-34/CSF-1R)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)中的表达。方法体外培养A549细胞;CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响;选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞(0、12、24、48h),提取细胞蛋白和RNA,Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏连蛋白(E-Cad)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的变化;Real-time PCR法检测IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响(P0.05)。TGF-β1刺激A549细胞后,间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降,纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高,MMP-9蛋白表达先升高后下降,TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后,呈持续降低趋势(P0.01)。IL-34mRNA表达逐渐升高,CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降(P0.01)。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中,存在IL-34/CSF-1R的动态表达。     

转化生长因子β1促进骨髓间充质干细胞迁移与上调Snail表达有关

背景：转化生长因子β1可促进骨髓间充质干细胞迁移及增殖,但机制尚不清楚。 目的：观察转化生长因子β1对体外培养的骨髓间充质干细胞侵袭力的影响,以及对Snail、基质金属蛋白酶2表达的调节作用。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞。用改良的Transwell小室检测0,0.5,1,2,5,10 μg/L的转化生长因子β1对细胞迁移的影响。用脂质体转染针对Snail基因的特异性小分子干扰RNA至骨髓间充质干细胞,观察转染前后Snail和基质金属蛋白酶2 的表达。 结果与结论：外源性转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞迁移的促进作用具有剂量依赖性,在2 μg/L时达到最高。在此浓度下,Snail、基质金属蛋白酶2 mRNA表达明显增高。Snail基因沉默可以明显抑制转化生长因子β1对基质金属蛋白酶2表达的促进作用。提示转化生长因子β1可通过促进骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶2的表达提高其迁移能力,此作用与上调Snail表达有关。     

Nrf2过表达对乙醇刺激下肝星状细胞激活与增殖及合成I型胶原的影响

 目的：探讨核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）过表达对乙醇诱导下大鼠肝星状细胞系HSC-T6激活与增殖及I型胶原mRNA及蛋白表达水平的影响。方法：采用脂质体介导法对HSC-T6进行pEGFP-Nrf2重组质粒及pEGFP-N1空载质粒瞬时转染,将细胞分为正常对照组、乙醇刺激组、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组和乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组。采用RT-PCR及Western blotting方法对HSC-T6中Nrf2、I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表达水平进行检测,采用MTT法对HSC-T6细胞增殖水平进行检测,采用流式细胞术对HSC-T6细胞周期分布进行检测。结果：(1) 荧光显微镜下观察显示pEGFP-Nrf2质粒成功转染HSC-T6,转染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表达水平较其余组显著升高（P＜0.05）。(2) 乙醇刺激组与乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组之间细胞增殖水平、I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,均明显高于正常对照组（P＜0.05）,细胞周期分布G1期比例下降,S期比例升高（P＜0.05）,而乙醇刺激+ pEGFP-Nrf2质粒组细胞增殖水平及I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平与乙醇刺激组及乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组相比均显著下降（P＜0.05）,细胞周期分布G1期比例显著上升,S期比例显著下降（P＜0.05）,呈G1/S期阻滞。结论：Nrf2过表达可显著抑制乙醇对HSC-T6 I型胶原及α-SMA mRNA及蛋白表达的促进作用,使HSC-T6细胞周期发生G1/S期阻滞,抑制乙醇诱导的HSC-T6增殖水平的升高,提示其对乙醇诱导的HSC-T6细胞活化具有负性调控作用。     

Activation of matrix metalloproteinase-2 from hepatic stellate cells requires interactions with hepatocytes.

Activation of matrix metalloproteinase (MMP)-2, the 72-kd collagenase IV/gelatinase A, is involved in extracellular matrix remodeling. It has been suggested that a membrane-type MMP (MT-MMP-1) and the tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-2 are involved in MMP-2 processing, but the exact mechanism(s) of its activation remains unclear. We have investigated the role of cell-cell cooperation in the activation of pro-MMP-2 in the liver, using pure cultures and co-cultures of hepatocytes and hepatic stellate cells (HSCs). Northern blot analysis and in situ hybridization showed that, in both pure and co-cultures, HSCs, but not hepatocytes, expressed MMP-2, TIMP-2, and MT-MMP-1 mRNA. Zymography analyses revealed the latent form of MMP-2 in medium from 2-day-old pure HSC cultures with higher amounts in medium from hepatocyte/HSC co-cultures. When hepatocytes were added to 10-day-old HSC cultures, the activated form of MMP-2 was detected, concomitantly with the deposition of an abundant extracellular matrix. Incubation of plasma membrane-enriched fractions from hepatocytes with conditioned medium from pure HSC cultures generated the activated species of MMP-2 (62 and 59 kd). Activation of pro-MMP-2 by hepatocyte membranes was inhibited by EDTA, heat, and trypsin but not by serine proteinase inhibitors. These data show that the co-expression of TIMP-2, MMP-2, and MT-MMP-1 by HSCs does not lead to secretion of the activated form of MMP-2. Hepatocytes, which do not express MMP-2, TIMP-2, or MT-MMP-1, induce MMP-2 activation through a plasma membrane-dependent mechanism(s), thus suggesting that cell-cell interactions are involved in this process in vivo.     

TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞间充质转化中的作用

目的:探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测16HBE细胞EMT过程中TRPC1 mRNA和蛋白的表达;Western blotting检测TRPC1阻断剂和siRNA干扰对16HBE细胞EMT的影响。结果:(1)TGF-β1刺激后细胞形态明显改变,E-钙黏蛋白表达减少(P0.01),而α-SMA蛋白表达增加(P0.05)。(2)TRPC1广泛存在于16HBE细胞,且TGF-β1刺激后TRPC1 mRNA和蛋白的表达增加(P0.05)。(3)与TGF-β1组相比,阻断剂和TGF-β1共同作用组或siRNA和TGF-β1共同作用组细胞形态改变受抑制,E-钙黏蛋白和α-SMA蛋白表达受抑制(P0.05)。结论:TGF-β1诱导16HBE细胞发生EMT,其机制可能与其上调16HBE细胞TRPC1有关。