碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体ELISA微量检测技术

目的：用本室制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测微量bFGF的技术。方法：将抗重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的杂交瘤细胞株，经再克隆化，选择高亲和力的抗bFGF杂交瘤细胞2H2。用Protein A亲和层析法对2H2腹水型单抗进行纯化。结果：用2H2 mAb建立了高灵敏度的间接、竞争ELISA检测bFGF方法，灵敏度分别达到10和1．0pg/孔，并用间接ELISA检测神经胶质瘤细胞SWO-38上清中的bFGF含量。结论：为实验研究和临床应用提供了微量bFGF的检测方法。     

抗O型口蹄疫病毒VP1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白VP1的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：以自行构建表达的O型FMDV—VP1表位重组蛋白（VP1epi）为抗原免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用Western blot、间接ELISA和斑点免疫测定法对mAb的特异性进行鉴定。结果：成功地获得1株分泌抗VPlepi重组蛋白mAb的杂交瘤细胞株“C7”，其分泌的mAb为IgG1亚类，能特异性地识别VP1epi重组蛋白，其腹水效价可达1：12800。斑点免疫测定法显示，该mAb能很好地识别灭活的FMDV。结论：VP1epi重组蛋白可代替FMDV制备抗天然FMDV—VP1的mAb。抗O型FMDV—VP1 mAb的成功制备，为进一步研究开发新型FMDV的检测方法奠定了基础。     

河南华溪蟹金属硫蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备小鼠抗河南华溪蟹金属硫蛋白(MT)单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法分别利用小泛素样修饰蛋白(SUMO)融合表达系统和碱性磷酸酶(phoA)分泌表达载体制备河南华溪蟹重组蛋白SUMO-MT和His-MT,以SUMO-MT为免疫抗原、His-MT为检测抗原,利用杂交瘤技术建立抗河南华溪蟹MT mAb杂交瘤细胞株。采用间接ELISA测定mAb腹水效价,Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特异性。结果成功建立了2株稳定分泌抗MT蛋白的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为mAb-MT2和mAb-MT3,均属于IgG1亚类。腹水效价分别为1∶500 000、1∶1000 000,Western blot和Dot-ELISA结果证实2株mAb均能特异性识别重组MT和内源性MT。结论成功制备了具有较高特异性的河南华溪蟹MT mAb。     

抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备和鉴定抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体(mAb),初步建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。方法:以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源性mAb,间接ELISA鉴定IgG亚类、腹水效价及亲和常数,Western blot检测mAb的特异性,用所得mAb致敏聚苯乙烯乳胶,建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。结果:筛选出2株能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株F1和F2,免疫球蛋白亚类均为IgG1类;腹水效价为0.5×106~1×106,亲和力常数分别为1.57×108M-1和5.43×109M-1。Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a,用mAb F2建立了乳胶凝集法,敏感性达1mg/L。结论:获得2株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株,为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。     

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

阿莫西林人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

目的:合成阿莫西林(AMX)完全抗原,获得稳定、高效分泌抗AMX单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。方法:采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法制备AMX-OVA(免疫原)AMX-BSA(检测抗原),紫外光谱分析检测偶联物克分子比,以AMX-OVA免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选分泌抗AMX mAb的杂交瘤细胞,体内诱生法制备腹水,辛酸-硫酸胺法从腹水中纯化mAb,ELISA法测定mAb亚类。结果:紫外光谱显示偶联物表现出小分子与蛋白载体叠加的特征,具有良好的免疫原性和反应原性。获得了5株可稳定分泌特异性抗AMX mAb的杂交瘤细胞株,亚类鉴定均为IgG1。mAb对AMX最小检测极限(limit of detection,LOD)为0.25 ng/mL,但与同属β-内酰胺类抗生素的氨苄青霉素有一定程度的交叉反应。结论:该细胞株可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求。     

抗HPT单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定

目的：制备抗潮霉素B磷酸转移酶(HPT)的单克隆抗体(McAb)，建立一种快速检测转基因作物中该选择标记基因HPT编码蛋白的方法。方法：用基因重组潮霉素B磷酸转移酶(HPT)抗原免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb。选择不同的抗原决定簇与兔抗HPT多抗配对，建立双抗夹心ELISA检测HPT抗原。结果：筛选出四株稳定分泌抗HPT单抗的杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定均为IgG1，ELISA检测证实单抗可特异性识别细胞培养上清、重组子菌体裂解产物中及纯化出的HPT蛋白。结合位点测定实验表明4株单抗是针对不同的抗原决定簇，与多克隆抗体组成双抗夹心ELISA法，均可较好地检测到HPT抗原。检测的灵敏度为30ng／ml，且与别的无关抗原无交叉反应性。结论：4株杂交瘤细胞株特异性好，亲和力强，组成双抗夹心ELISA法可用于快速、灵敏检测HPT抗原。     

抗大鼠Nogo分子单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备抗大鼠Nogo分子单克隆抗体(mAb)，为研究Nogo分子的组织分布和功能提供实验手段。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠源性抗大鼠Nogo mAb。用免疫荧光组织化学技术，对Nogo分子在大鼠中枢神经系统(CNS)的分布进行鉴定。结果：获得3株分泌抗Nogo mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA测定腹水效价达10^-6，两株mAb为IgG1(κ)亚类，另一株为IgG2b(κ)，在免疫荧光组织化学技术应用中获得较满意效果。结论：获得3株能特异性识别天然Nogo分子的mAb，为进一步研究Nogo分子的结构和功能奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备特异性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体单克隆抗体,为建立TRAIL酶联吸附检测方法奠定基础。方法以原核表达系统重组制备的可溶性人sTRAIL作为抗原,利用杂交瘤技术筛选获得抗人TRAIL?mAb杂交瘤细胞株。体内诱生法生产腹水,经间接ELISA方法检测腹水效价,Western?blot鉴定抗体特异性。结果制备获得一株可稳定分泌抗人TRAIL?mAb的杂交瘤细胞株,属IgG2b亚类;腹水效价达1:5×106以上,Western?blot鉴定结果显示可特异性识别人TRAIL,而与TNF-α和Fas-l无明显的交叉反应。结论制备了具有高特异抗原结合特性的TRAIL?mAb。     

鼠抗人内皮抑素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人内皮抑素的单克隆抗体(mAb),为深入研究内皮抑素的作用机制提供一种有用的试剂。方法:以毕赤酵母表达的内皮抑索为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选分泌抗人内皮抑素的特异性mAb的杂交瘤细胞株,并诱生腹水。腹水中的mAb采用 Protein A Sepharose CL-4B进行纯化。以标准的抗Ig血清做ELISA,鉴定mAb的Ig类、亚类及型;用免疫印迹法鉴定mAb的特异性。结果:获得1株可分泌抗人内皮抑素mAb的杂交瘤细胞株4E7,该株杂交细胞分泌的mAb属于IgGl(λ型)。腹水mAb的效价为1×10-4-1×10-6,纯化后大于1×10-10。免疫印迹结果显示,mAb 4E7可特异性地与酵母及大肠杆菌表达的内皮抑素起反应,而与bFGF等其他细胞因子不发生交叉反应。结论:分泌抗人内皮抑素mAb杂交瘤细胞株的建立,为进一步研究奠定了基础。     

抗人白细胞介素15单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的 :制备鼠抗人白细胞介素 15(hIL 15)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。方法 :自重组人白细胞介素 15(rhIL 15)基因工程菌中 ,提取融合蛋白GST IL 15,以 12 0g/LSDS PAGE分离鉴定 ,切取含有目的条带的凝胶 ,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 / 0骨髓瘤细胞常规融合 ,依次进行HAT选择培养 ,间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及克隆化。对杂交瘤细胞株的稳定性及其分泌的mAb的特性进行鉴定。另外 ,以rhIL 15包涵体蛋白 (rhIL 15IBP)免疫新西兰白兔 ,制备抗hIL 15的多克隆抗体 (多抗 )。用抗hIL 15的mAb与多抗建立双抗体夹心间接ELISA。结果 :获得 1株可稳定分泌特异性抗hIL 15mAb的杂交瘤细胞。建立了双抗体夹心间接ELISA ,检测rhIL 15蛋白的敏感性达 10 μg/L。结论 :成功地制备抗hIL 15mAb ,并建立了一种可用于hIL 15检测的双抗体夹心间接ELISA。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

抗人FKBP52分子单克隆抗体的制备和鉴定

目的；研制抗人FKBP52单克隆抗体（mAb)，并分析其免疫生物学特性。方法：采用纯化的人FKBP52蛋白免疫BALB／c小鼠。用ELISA法鉴定mAb的特异性；用Western blot鉴定制备的9株mAb所识别的抗原相对分子质量（Mr)及结合人FKBP52分子的功能区。结果：共获得9株分泌抗人FKBP52 mAb的杂交瘤细胞。抗人FKBP52 mAb可识别相对Mr为52000在原核系统中表达的人FKBP52蛋白，也可识别Jurkat细胞浆中Mr为52000的天然FKBP52蛋白。两株mAb均可识别人FKBP52分子中的第2功能区。其余7株mAb可识别人FKBP52分子中的第3功能区。结论：成功地制备了抗人FKBP52分子mAb。     

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

A SENSITIVE ELISA FOR THE DETECTION OF BOVINE CRUDE HEPARIN IN PORCINE HEPARIN

Heparin is an effective anticoagulant drug which has been purified for decades from bovine or porcine tissues. However, with the emergence of BSE, heparin purification is today restricted to porcine intestinal mucosa. To control the origin of crude heparins, polyclonal antibodies were raised against bovine contaminants. These antibodies were used to develop one sandwich and two competitive indirect ELISAs. Optimal results were obtained with competitive indirect ELISA, using bovine crude heparin for the coating and anti-bovine crude heparin as a detector antibody. The detection limit of the assay was 1 ppm of bovine crude heparin in a porcine heparin. Taking into account the variability of the background obtained for 10 crude and 9 pure porcine heparins from known origin, the detection level was 5 ppm. Ovine and caprine crude heparins cross-reacted slightly (6–17 ppm).     

A sensitive ELISA for the detection of bovine crude heparin in porcine heparin

Heparin is an effective anticoagulant drug which has been purified for decades from bovine or porcine tissues. However, with the emergence of BSE, heparin purification is today restricted to porcine intestinal mucosa. To control the origin of crude heparins, polyclonal antibodies were raised against bovine contaminants. These antibodies were used to develop one sandwich and two competitive indirect ELISAs. Optimal results were obtained with competitive indirect ELISA, using bovine crude heparin for the coating and anti-bovine crude heparin as a detector antibody. The detection limit of the assay was 1 ppm of bovine crude heparin in a porcine heparin. Taking into account the variability of the background obtained for 10 crude and 9 pure porcine heparins from known origin, the detection level was 5 ppm. Ovine and caprine crude heparins cross-reacted slightly (6-17 ppm).     

抗弓形虫P30单克隆抗体的制备及其抗虫作用观察

制备抗弓形虫天然P30、重组P30的单克隆抗体(mAb),并研究它们对虫体的影响,为弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定奠定基础。采用弓形虫天然P30、重组P30及全虫抗原(对照)分别免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选稳定分泌高滴度mAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定mAb亚类和效价;通过SDS-PAGE和West-ern blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目;利用扫描电镜及间接荧光抗体试验(IFAT)观察mAb对弓形虫的杀伤作用及其靶抗原定位。结果表明,筛选出2株(2B3、1H6)特异性较好、能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示,2B3、1H6产生的mAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30 000 Mr处;mAb亚类均属IgM,其效价(ELISA)分别为:2B3 1∶102 400、1H6 1∶51 200;2株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察与mAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀,膜变厚,表面出现缺口和空洞,甚至虫体变形、破碎。抗弓形虫天然P30的mAb能识别重组体pET-30a-P30的表达蛋白。成功制备了抗弓形虫天然P30、重组P30的mAb,可进一步用于弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定研究。     

自制NSE单抗的鉴定及其双抗夹心ELISA方法的建立

目的:制备并鉴定NSE(Neuron-specific enolase)单克隆抗体,建立可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:用本实验室已表达纯化的NSE融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用WB、IP、IF、IHC等方法对获得的NSE单抗进行鉴定及亚型检测。利用辣根过氧化物酶标记纯化后的NSE单抗,建立一个可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA法。结果:通过分析和鉴定,选定2株可稳定分泌抗NSE抗体的杂交瘤细胞株,效价达4.2×107～6.5×107,亚型为IgG2b。免疫印迹结果显示,该抗体不仅能识别细胞内源NSE蛋白,还能识别分泌到细胞培养上清液中的NSE蛋白,此外还可用于免疫荧光及免疫组化检测。文中所建立的双抗夹心ELISA法,最低检测极限为8.85 ng/ml。结论:成功获得了效价高、灵敏度好及特异性强的NSE单抗,建立了一个双抗体夹心ELISA检测系统,具有良好的临床应用前景。     

β-Netrin抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的:制备抗神经细胞突起生长诱向因子(β-Netrin)的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:应用GoldKey软件分析人βNetrinC末端结构域氨基酸的序列(共114个氨基酸),确定抗原表位并人工合成多肽。然后采用碳化二亚胺法,将合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行HAT选择培养,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞并克隆化。对分泌的mAb的效价、Ig亚类(型)及特异性,分别用间接ELISA和Westernblot进行鉴定。同时,通过免疫细胞化学染色鉴定抗体的特异性。另外,以偶联的分子免疫新西兰白兔,制备抗β-Netrin的pAb,用Westernblot鉴定其特异性。结果:以确定的此16个氨基酸的序列NH2-FRGKRT-LYPESWTDRG-COOH作为抗原表位,以人工合成多肽与BSA偶联作为免疫原,获得3株可稳定分泌特异性抗β-Netrin mAb的杂交瘤细胞。免疫细胞化学染色结果表明,这3株抗体均能特异性地识别细胞中的抗原。另外,制备了高效价的抗β-Netrin的pAb,并能特异性地识别原核表达的β-Netrin蛋白。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功地制备出抗β-Netrin的pAb和mAb。