应用肿瘤坏死因子基因转染肿瘤浸润淋巴细胞进行肝癌基因治疗的实验研究

目的：探讨转基因肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytem,TIL)治疗肝癌的价值。方法：用转基因技术将肿瘤坏死因子(TNF—α)基因导人人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞，构建转基因TIL。用肝癌细胞株BEL7404注射裸鼠建立裸鼠肝癌移植瘤，用转基因TIL分原位及异位进行治疗，并用TIL作对照。结果：转基因TIL表现出较高的抑制肿瘤作用，对肿瘤的生成率、生长速度的抑制作用比未转基因TIL强。原位注射转基因TIL的抗肿瘤作用较强，优于异位注射治疗。结论：转基因TIL对裸鼠移植性肝癌的实验治疗具有较好作用，本研究为人肝癌的基因治疗研究提供依据。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株，研究野生型ｐ５３蛋白在诱导瘤细胞凋亡中的作用。方法：用ＤＮＡ转染技术将７重组野生型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，用ＰＣＲ技术监测外源性ｐ５３基因在瘤细胞中存在的稳定性；用免疫组化方法检测在地塞米松的诱导下瘤细胞中ｐ５３的表达情况；用相差显微镜去观察凋亡瘤细胞的形态特点；用细胞凋亡原位检测技术标记并统计凋亡的瘤细胞数。结果：成功地将重组野性型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ８６０３中，在ｇｐｔ选择培养基中培养两周后，分离生长出阳性细胞克隆；经ＰＣＲ证实外源性ｐ５３基因在瘤细胞内稳定存在并可随瘤细胞分裂而传给子代；当向培养液中加入１μｍｏｌ／Ｌ地塞松（Ｄｅｘ）后，８ｈ即可用免疫组化方法检测到ｐ５３蛋白的表达并可观察到瘤细胞出现凋亡的一系列形态学改变，转染后的瘤细胞凋亡率高达９０％。结论：当人骨肉瘤细胞株中重组野生型ｐ５３基因诱导过表达时，瘤细胞呈现凋亡，本实验为骨肉瘤的基因治疗提供了理论依据。     

反义技术封闭增殖细胞核抗原对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

为探讨用反义技术治疗骨肉瘤的可能性，将针对增殖细胞核抗原(PCNA）mRNA的不同剂量的反义寡核苷酸（ASODN）导入人骨肉瘤Saos-2细胞株，用^3H-TdR掺入法，免疫组化及双层软琼脂培养法检测其对肿瘤细胞增殖。PCNA表达及成瘤能力的影响。结果表明，ASODN能显著抑制Saos-2细胞增殖及PCNA表达，抑制作用呈剂量依赖性，30μmol/L浓度即可完全抑制PCNA表达，软琼脂培养无集落形成。表明通过反义技术抑制PCNA基因表达可对骨肉瘤细胞恶性表型产生逆转作用，开辟了骨肉瘤基因治疗的新途径。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株，研究野生型ｐ５３蛋白在诱导瘤细胞凋亡中的作用。方法：用ＤＮＡ转染技术将７重组野生型ｐ５３基因ＰＭ４７质粒导入人骨肉瘤细胞株ＨＯＳ－８６０３中，用ＰＣＲ技术监测外源性ｐ５３基因在瘤细胞中存在的稳定性；用免疫组化方法检测在地塞米松的诱导下瘤细胞中ｐ５３的表达情况；用相差显微镜去观察凋亡瘤细胞的形态特点；用细胞凋亡原位检测技术标记并统计凋亡的瘤细胞数。结     

脂质体包裹TGF-α反义脱氧寡核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖

目的 研究用转化生长因子α（TGF-α）反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对人大肠癌细胞株HR8348生长增殖的作用,探讨大肠癌治疗的新途径。方法 采用人工全盛的TGF-α反义及无关对照ODN经阳离子脂质体包裹后转染人大肠癌HR8348细胞,采用MTT法,[^3H]-TdR掺入实验。细胞周期分析,裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化。结果 经TGF-α反义ODN处理的HR8348细胞与对照组HR8348细胞相比,体外增殖速度减慢（细胞增殖抑制率达71%）,DNA合成受抑,裸鼠体内成瘤率下降（25%vs100%)。结论 TNF-α反义ODN能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖,可用于实验性肿瘤基因治疗研究。     

VEGF反义核酸对Lewis肺癌细胞作用的研究

目的 探讨利用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡核苷酸的基因治疗肺癌.方法 制作C57BL/6小鼠皮下肺癌模型30只,分为VEGF反义寡核苷酸(ASODN)治疗组、VEGF正义寡核苷酸(SODN)治疗组及对照组.接种Lewis肺癌细胞后24h内,用ASODN及SODN皮下注射进行治疗,对照组只注射生理盐水,观察小鼠肿瘤的生长情况.用免疫组化方法检测VEGF蛋白表达,RT-PCR方法检测VEGF mRNA的表达.结果 VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组、对照组平均瘤重分别为(4.31±0.45)g、(6.47±0.71)g、(6.23±0.76)g.VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组抑瘤率分别为41.8%、5.2%.VEGF反义寡核苷酸能明显抑制VEGF蛋白表达及VEGF mRNA的表达.结论 原位注射VEGF反义寡核苷酸能抑制小鼠肺癌生长.     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

血管内皮生长因子反义RNA对人脑垂体瘤细胞的作用

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）反义RNA对人脑垂体瘤细胞的抑制作用,探讨以VEGF反义RNA进行生垂体瘤基因治疗的可行性。方法：将VEGF反义cDNA、正义VEGFcDNA质凿转染垂体瘤细胞,通过Northern印迹杂交鉴定其表达,测定被转染细胞生长率,用原位发校和免疫组化法检测VEGFmRNA及蛋白表达。结果：经鉴定被转染的垂体瘤细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,其VEGFmRNA及蛋白表达水平降低,但其生长速率无明显减曼。结论：VEGF在垂体瘤血管形成及发生、发展中起重要作用。可能成为基因治疗垂体瘤的优选靶的之一。     

用射线照射的B7-1转基因细胞进行肿瘤疫苗的研究

目的探讨用放射的B71转基因细胞进行肿瘤疫苗疗法的效果。方法将重组人B7-1基因真核表达载体导入CAK-1肾细胞瘤细胞,利用转基因细胞治疗观察其抗肿瘤效果。结果转基因细胞的肿瘤原性较CAK-1／Wt、CAK-1／pCDNA3组明显降低（P〈0．001）。同时免疫原性明显增强,以^60Co照射的CAK-1／B7-1细胞免疫后,小鼠体内诱发了抗CAK-1／Wt的系统性、保护性免疫。用^60Co灭活的转基因细胞作为瘤苗进行实验性治疗,能够延长小鼠的生存时间,减慢肿瘤的生长速度,CAK-1／H7-1的应用提高了肿瘤治疗效果（P〈0．01）。结论放射的转基因细胞及其表达的H7细胞因子可以有效地激发机体的抗肿瘤免疫应答,B71表达肿瘤细胞应用可以成为一种很有前景的肿瘤疫苗。     

含CD基因的腺病毒载体制备及体外抑瘤效果观察

目的：制备含胞嘧啶转氨酶（CD）基因的重组腺病毒（Ad-CD)并进行体外肿瘤的自杀基因治疗。方法：构建含CD或LacZ基因的重组腺病毒载体。在293细胞内重组包装后,体外感染小鼠结肠癌细胞株C26,并给予不同浓度的前药氟胞嘧啶（5-FC）进行肿瘤杀伤效果观察。结果：重组腺病毒载体构建成功。用制备的Ad-CD液感染C26细胞,并予以不同浓度5-FC后,肿瘤细胞生长受不同程度抑制,而对照组细胞和原位转LacZ基因的C26细胞的生长未出现明显的变化。结论：应用腺病毒载体转CD基因进行体外肿瘤治疗效果明显,为自杀基因应用于体内结肠癌的基因治疗研究奠定基础。     

转染人Rb反义寡脱氧核苷酸对骨肉瘤细胞生长的影响

目的从分子水平研究Rb基因对骨肉瘤生长的影响,为骨肉瘤的基因治疗提供依据.方法用脂质体将人工合成的Rb反义寡脱氧核苷酸转入有Rb表达的人成骨肉瘤细胞.免疫组化方法检测肿瘤中Rb蛋白表达,MTT法检测细胞转染前后的增殖情况.同时流式细胞术检测细胞周期.结果转染Rb反义寡核苷酸后肿瘤细胞的Rb蛋白表达明显下降,G1期细胞比例减少,细胞增殖增加.结论转染Rb反义寡核苷酸的细胞,Rb蛋白表达明显降低,并引起肿瘤细胞增殖增加.     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。     

血管生成抑制素基因对人原发性肝细胞癌裸鼠移植瘤的治疗作用

目的：研究血管生成抑制素基因对人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤的治疗作用。方法：建立人原发性肝癌裸小鼠皮下移植瘤模型。将荷瘤裸小鼠随机分为3组；肿瘤对照组，空载体组及angio基因治疗组分别瘤内直接注射裸露DNA质粒，不同时段观察皮下肿瘤生长情况，绘制计算皮下肿瘤生长曲线：病理学检查；原位末端标记（TUNEL）法检查细胞原位凋亡；放射免疫法检测裸小鼠血清甲胎蛋白变化；透射电镜观察细胞超微结构变化。结果：皮下肿瘤生长曲线及病理学检查结果显示，angio基因瘤内注射可部分抑制肿瘤生长。TUNEL法检测显示，angio组凋亡指数明显高于肿瘤对照组。扫描电镜观察细胞超微结构变化。发现angio基因治疗组内有明显的细胞凋亡发生。结论：angio基因直接瘤内注射能抑制人原发性肝癌裸小鼠移植瘤肿瘤生长。其作用机理可能为抑制肝癌的血供从而抑制肿瘤生长。     

γ-干扰素基因治疗大肠癌及其肝转移的实验研究

目的:探讨利用γ鄄干扰素(IFN鄄γ)基因治疗对大肠癌及肝转移的预防和治疗作用,并初步探讨其作用机制。方法:利用BALB/C小鼠成瘤的小鼠结肠癌CT26细胞株制备小鼠结肠癌腹腔转移瘤模型,用携带鼠IFN鄄γ基因的重组缺陷型腺病毒AdIFN鄄γ进行治疗,同时利用携带LacZ基因的腺病毒AdLacZ和PBS作空白对照,检测经基因治疗后小鼠体内IFN鄄γ基因的表达情况、脾脏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性变化、肿瘤局部的淋巴细胞浸润情况、肝转移的发生及荷瘤小鼠的生存期。结果:经IFN鄄γ基因治疗后,与对照组相比,治疗组小鼠血清中IFN鄄γ表达量明显增加(P<0.01),脾脏的CTL活性明显增强(P<0.01),肿瘤生长受到抑制,肝转移的发生率明显下降,荷瘤小鼠的存活期明显延长。结论:利用IFN鄄γ基因治疗大肠癌具有明显的疗效,并对大肠癌肝转移具有一定的预防和治疗作用。     

VEGF反义寡核苷酸抑制裸鼠骨肉瘤生长的实验研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用。方法制备BALC/C裸鼠皮下骨肉瘤模型18只,随机分为3组:VEGF反义寡核苷酸(ASODN)治疗组、VEGF正义寡核苷酸(SODN)治疗组及对照组,每组6只。接种MG-63人成骨肉瘤细胞后24 h内,分别皮下注射ASODN及SODN进行治疗,对照组只注射生理盐水,每周2次,连续4周;观察各组裸鼠肿瘤的生长情况、裸鼠的一般情况与生存期。断颈处死裸鼠,游标卡尺测量肿瘤体积大小,天平称量肿瘤的重量。结果与对照组瘤重(7.45±0.60 g)比较,VEGF ASODN组(4.13±0.80 g)能明显抑制裸鼠肿瘤生长(P<0.01),VEGF SODN组(6.92±0.69 g)则无明显抑制作用(P>0.05)。VEGF ASODN组、VEGFSODN组抑瘤率分别为44.56%、7.11%。结论VEGF反义寡核苷酸能抑制裸鼠体内骨肉瘤生长,通过反义寡核苷酸下调VEGF的表达,可达到治疗骨肉瘤的目的,为骨肉瘤的基因治疗提供了实验依据。     

骨肉瘤与活化B淋巴细胞融合疫苗的抗肿瘤效应

目的　建立骨肉瘤与活化 B淋巴细胞融合的肿瘤疫苗 ,探讨其生物学与抗肿瘤特性 .方法　以 50 0 g· L-1 聚乙二醇为融合剂 ,将 C3 h小鼠来源的 HGRPT基因缺陷型 LM9骨肉瘤细胞与脂多糖活化的小鼠 B淋巴细胞进行融合 .经HAT选择性培养基筛选后 ,再观察该融合瘤株的体内外生长特性 ,对小鼠的致瘤性以及抗肿瘤活性 .结果　该融合瘤株体外生长缓慢 ,对 C3 h小鼠无致瘤性 ,杂交瘤细胞细胞表达B7(70 .6% ) H- 2 Kb (53.4% ) ,融合疫苗保护的小鼠可获 1 0 0 %无瘤生存 (8/ 8)而 LM9和射线照射后的 L M9对照组小鼠全部死亡 (0 / 8) ,皮下接种融合疫苗治疗的荷瘤小鼠可获得80 %无瘤生存 .结论　活化 B淋巴细胞融合骨肉瘤细胞可能改变其生物学特性 ,对小鼠有较好的预防和治疗作用 ,说明了细胞融合方法构建的肿瘤疫苗具有潜在的应用价值     

针对HBV X基因区三个关键位点的反义寡核苷酸体内抑瘤研究

目的：研究HBV X基因区关键区段的反义寡核苷酸（asON)对人肝癌裸小鼠模型的抑瘤生长及体内抗HBV作用。方法：PCR法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸及无关对照序列，进行硫代化修饰，以HBV DNA转染的H G2.2.15细胞接种裸小鼠，24h内同部位一次性用药100μg，观察并比较3种反义硫代寡核苷酸的体内抑瘤作用。ELISA法检测反义核酸作用裸小鼠血清中HBsAg和HBeAg含量的变化。结果：3种药物作用裸小鼠组均表现为出瘤潜伏期延长，出瘤率明显低于未用药瘤细胞对照组（P＜0．05），且瘤体生长缓慢。互补于Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸一次性给药方式对荷瘤鼠HBsAg和HBeAg的表达无明显抑制作用；无关序列不影响荷瘤鼠瘤体生长及HBV抗原表达。结论：针对HBV X基因区关键部位的反义寡核苷酸可抑制荷瘤裸小鼠人肝癌的生长，为HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。     

转染MIP-1α和B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤效应的初步研究

【摘要】 目的 观察转染趋化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因增强小鼠抗淋巴瘤的效应。方法 将MIP-1α和B7-1基因慢病毒重组载体转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞,应用RT-PCR检测MIP-1α和B7-1基因mRNA表达,Western blot法检测MIP-1α和B7-1蛋白表达;转基因EL-4细胞注入小鼠右腋皮下,观察成瘤情况;灭活的转基因EL-4细胞注入成瘤小鼠体内,观察其增强小鼠抗淋巴瘤效应。结果RT-PCR检测发现EL-4/MIP-1α+B7-1细胞内有MIP-1α及B7-1mRNA表达,Western blot显示MIP-1α及B7-1蛋白表达;MIP-1α组、B7-1组较对照组成瘤时间延长,成瘤率降低,肿瘤平均体积较小,而联合组成瘤性消失;MIP-1α和B7-1治疗组的肿瘤平均体积、重量及肿瘤器官转移率明显小于对照组（P＜0.05）,而联合组的肿瘤平均体积及重量明显小于MIP-1α和B7-1组（P＜0.05）,而且联合组小鼠平均生存期,均较单基因组、对照组明显延长（P＜0.05）。结论 转染MIP-1α和B7-1基因能够明显增强小鼠机体抗淋巴瘤效应,明显延长荷瘤小鼠的平均生存期,为淋巴瘤的基因治疗提供了新的思路。     

人肺癌细胞γ-干扰素基因的转染及特性分析

目的:建立转基因A549细胞株,从特性上进行分析,探讨其作为抗肿瘤瘤苗的可能性.方法:将pLXSN质粒与人IFN-γ基因体外重组,转染入人肺腺癌细胞株A549中,经筛选获得稳定表达γ-干扰素的A549-IFN-γ细胞株,对其生长特性、细胞表面MHC分子表达变化、IFN-γ的分泌量及致瘤性等方面进行了探讨.结果:转基因细胞株与原细胞株相比较,生长状态没有明显的变化,转基因细胞株可稳定表达并向细胞外分泌γ-干扰素;而且其细胞表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达明显增加,提示其免疫原性增强;裸鼠实验表明其致瘤性下降.结论:该转基因细胞株有可能成为治疗肺癌的转基因瘤苗.     

反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡

目的观察反义血管内皮生长因子(anti-VEGF)原位表达对白血病细胞系K562在裸鼠体内生长的影响。方法选用白血病细胞系K562裸鼠体内接种成瘤后,肿瘤内注射重组反义VEGF真核表达质粒及空载体和PBS,检测反义VEGF体内转染情况及其对肿瘤生长的影响;免疫组化法比较实验组和对照组移植瘤微血管密度(MVD)及白血病细胞的凋亡情况。结果注射反义VEGF表达质粒能抑制肿瘤的生长,使肿瘤的MVD显著降低(25.6±5.77VS41±3.8,P<0.05),并且使肿瘤细胞凋亡增加。结论肿瘤内注射反义VEGF重组表达质粒在体内能有效转染肿瘤及其周围组织,反义VEGF体内的表达能抑制白血病细胞肿瘤的生长,降低肿瘤内MVD,促进白血病细胞的凋亡。反义VEGF基因治疗策略提供了一种新的白血病辅助治疗方案。