折质定点诱变技术的进展

蛋白质定点诱变技术是研究基因表达、蛋白质结构与功能关系，蛋白质的稳定性及分子进化等的重要工具。已发展了大量诱变质粒ＤＮＡ特殊碱基的有效操作程序。所有的方法都按在体外用带有预先设计诱变部位的寡核苷酸与已知序列靶基因序列错配异源杂交、合成定点诱变的ＤＮＡ完成的。对具有代表性的Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ法、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｐｒｏｍｅｇａ法、Ｄｅｎｇ和Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ法进行了综述，并讨论了它们的优点和局限性。     

大草履虫总DNA的提取方法比较

快速而稳定地提取大草履虫的基因组DNA是进行后续分子生物学研究的前提.文章通过比较传统SDS法、CTABⅠ法和CTABⅡ法等提取大草履虫DNA的效果,进一步优化提取方法,获得快速稳定地提取大草履虫基因组DNA的方法.结果表明:用CTAB I法提取的DNA浓度低,杂质较多;CTABII提取的DNA电泳时检测不出条带;而SDS法提取的DNA在电泳时带型较整齐,无降解,且DNA的得率和纯度较高,但仍有蛋白质污染.针对蛋白质的去除,用SDS-蛋白酶K法和SDS-NaAc法来提取DNA,经过试验发现这2种方法都能够很好地去除蛋白质,所获DNA样品的纯度和得率都能用于进一步分子试验,而SDS-NaAc法更经济适用.     

法夫酵母人工诱变及突变株筛选的研究

用硫酸二乙酯对法夫酵母进行了诱变，并用薄层色谱法及高效液相色谱法对突变株进行了筛选鉴定,当诱变剂浓度为1％、诱变温度为20℃时，法夫酵母诱变处理的最适时间约为5min．根据视觉差异分离二苯胺平板上长出的法夫酵母菌落，用薄层色谱法初筛，并用液相色谱法鉴定出了虾青素高产菌株、虾青索低产菌株、类胡萝卜素组成缺陷菌株．     

日本囊对虾性腺蛋白质双向电泳的样品制备方法的改进

采用一种能同时提取RNA、DNA和Protein的试剂(RDP试剂)进行日本囊对虾性腺总蛋白质的制备,并通过双向电泳(2 - DE)技术与传统的裂解液法比较提取效果.RDP法所得2- DE图谱清晰,条纹少,蛋白质点数多,而裂解液法存在横向和纵向拖尾,其碱性端蛋白质点大量缺失,说明RDP法能有效去除蛋白质样品中盐离子、脂...     

导入大豆总DNA改良大麦籽粒营养品质

利用花粉管通道法和基因枪法将大豆总DNA直接导入大麦。采用微量凯氏定氮法和氨基酸自动分析仪进行大麦后代籽粒蛋白质含量和氨基酸含量分析。结果显示：(1)经花粉管通道法导入大豆总DNA获得的大麦后代有6个单株籽粒蛋白质含量明显超过对照(12．91％)，它们是18．23％，16．61％，16．42％，16．58％，16．22％和16．38％，占总数比例的7．06％；(2)经基因枪法导入大豆总DNA共获得12个单株籽粒蛋白质含量明显超过对照(13．29％)，它们的蛋白含量分别为16．70％，16．52％，17．9l％，19．59％，17．44％，18．56％，18．46％，17．3l％，16．5l％，18．8l％，18．8l％和19．02％，占总数比例的8．33％；(3)籽粒氨基酸含量分析显示在高蛋白变异后代中，随着籽粒蛋白质含量增加的同时，籽粒总氨基酸和各种必需氨基酸含量也有明显提高．经直线相关分析显示，导入大豆总DNA的后代籽粒赖氨酸等6种必需氨基酸含量与总氨基酸含量呈极显著正相关关系。本试验结果充分说明，直接导入大豆总DNA有可能提高大麦籽粒的蛋白质含量及质量。     

三丁基氧化锡（TBTO）对太平洋牡蛎性成熟的影响

利用流水饲养法研究了不同浓度的三丁基氧化锡（0．5μg/L和1．0μg/L TBTO)太平洋牡蛎卵巢中卵母细胞直径、RNA／DNA比、蛋白质和卵黄蛋白含量的影响。卵母细胞径的增长在0．5μg/L实验组受到阻碍,并随着TBTO浓度的增大而更加明显。TBTO暴露组的RNA／DNA比在精巢中无明显变化,但在卵巢中显著低于对照组。TBTO暴露组的卵巢中蛋白质和卵黄蛋白含量显示了与RNA／DNA比相同的变化趋势,表明TBTO的积累阻碍卵黄蛋白的合成。TBTO暴露42d采集的牡蛎样品中出现3个雌雄同体,暗示TBTO可能引起牡蛎发生性转变进而产生雌雄同体。     

微量苔藓样品DNA提取实验方案改良

苔藓植物个体微小，为得到一种适于苔藓微量样品使用的DNA提取方案，首先对前人提取植物DNA的方法进行了筛选；其次对所选择的3种适于提取苔藓样品DNA的方法——CTAB法、尿素法和磁珠法进行了改良；最后通过使用上述3种改良方法对牛角藓Cratoneuron filicinum植物样品总DNA进行提取，并比较了提取效果、提取时间和费用.结果显示：3种改良方法均可从2 mg干燥牛角藓材料中提取总DNA并得到阳性PCR结果.其中，改良磁珠法提取的DNA浓度较高，提取过程时间短，但成本高于其他2种方法.改良CTAB法提取的DNA浓度低于磁珠法，且实验耗时长，但DNA纯度较高，且实验成本仅为磁珠法的5%.PCR实验显示改良磁珠法与改良CTAB法的扩增成功率均为100%,而改良尿素法的扩增成功率仅为75%.认为改良磁珠法与改良CTAB法均可作为微量苔藓样品DNA提取的优选方案.     

太白红杉总DNA的快速提取方法

对太白红杉总DNA提取方法进行了探讨，并对其不同部位和器官、不同处理方式材料进行了提取实验研究．通过琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶处理等方法对所提取的DNA样品进行检测．结果表明，改良后的CTAB法，对于太白红杉总DNA的提取是一种良好的简单易行的方法，无论是烘干后的材料还是新鲜材料提取的总DNA中基本没有蛋白质及酚类污染．该方法可在短时间内获得大量的DNA样品，并可根据需要对样品进行适当操作．     

不同方法提取鳗鲡病原茵DNA模板的差异分析

利用吸光值、琼脂糖电泳及PCR差异扩增等指标,对酚一氯仿法、水煮法、碱裂解法3种方法制备的鳗鲡病原菌DNA模板进行了差异分析．结果表明：1）不同方法提取的病原菌模板DNA的浓度、纯度及分子质量大小存在差异,但以这3种方法提取的病原菌DNA为模板,均能成功扩增到细菌16SrD．NA和外膜蛋白的保守序列．其中,酚一氯仿提取的模板DNA浓度较低、纯度较高;水煮法和碱裂解法提取的模板DNA浓度较高、纯度较低．2）电泳显示,3种方法获得的模板DNA扩增出的16SrDNA保守序列条带均一,没有显著差异,但在外膜蛋白保守序列的扩增中却因菌种和模板提取方法的不同而存在差异．     

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．     

Complete mutagenesis of the HIV-1 protease

Retroviruses encode a protease which needs to be active for the production of infectious virions. A disabling mutation in the protease results in the production of non-infectious virus particles and examination of proteins from these mutant virions reveals unprocessed Gag and Gag-Pol precursor proteins, the substrates of the viral protease. Each amino acid of the HIV-1 protease was individually mutated using a simple mutagenesis procedure which is capable of introducing and identifying missense mutations in each residue of a protein. Phenotypic screening of these mutants in a heterologous assay system reveals three regions within the protease where multiple consecutive amino-acid residues are sensitive to mutation. These results show that random mutagenesis can be used to identify functionally important regions within a protein. Mutants with conditional phenotypes have also been identified within this collection.     

蛋白质分子的定点突变和化学修饰

回顾蛋白质工程研究及应用技术、手段和方法,分析定点突变及化学修饰在改造蛋白质分子结构与功能方面的异同。定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素导致突变的方法相比,具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。     

A model for SOS-lesion-targeted mutations in Escherichia coli

The UmuD'2C protein complex (Escherichia coli pol V) is a low-fidelity DNA polymerase (pol) that copies damaged DNA in the presence of RecA, single-stranded-DNA binding protein (SSB) and the beta,gamma-processivity complex of E. coli pol III (ref. 4). Here we propose a model to explain SOS-lesion-targeted mutagenesis, assigning specific biochemical functions for each protein during translesion synthesis. (SOS lesion-targeted mutagenesis occurs when pol V is induced as part of the SOS response to DNA damage and incorrectly incorporates nucleotides opposite template lesions.) Pol V plus SSB catalyses RecA filament disassembly in the 3' to 5' direction on the template, ahead of the polymerase, in a reaction that does not involve ATP hydrolysis. Concurrent ATP-hydrolysis-driven filament disassembly in the 5' to 3' direction results in a bidirectional stripping of RecA from the template strand. The bidirectional collapse of the RecA filament restricts DNA synthesis by pol V to template sites that are proximal to the lesion, thereby minimizing the occurrence of untargeted mutations at undamaged template sites.     

人胰岛素原类似物（B-Arg-Arg-A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（PCR）法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物（BArg-Arg-A）基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR₂A。再将pUC18BR₂A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

毒性小分子蜂毒肽基因的克隆修饰、融合载体构建及表达研究

通过定点诱变的方法，对小分子蜂毒肽（melitin）基因进行修饰，引入了羟胺裂解位点，使蜂毒肽与其前体蛋白得以在体外融合表达．将融合的蜂毒肽前体蛋白（prcmelittin）经双酶切后克隆到原核表达载体PET-42a（＋）中，PCR鉴定后转化至宿主菌BL21（DE3）中，在异丙祭硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下，在大肠杆菌中实现融合表达．为利用基因下程的方法表达毒性小分子多肽、实现该类药物的产业化打下基础．     

Sequence requirements for nuclear location of simian virus 40 large-T antigen

A point mutation in the simian virus 40 large-T gene, which was generated by mixed oligonucleotide mutagenesis and resulted in the conversion of Lys 128 to Thr, produced a large-T antigen that was detected in the cytoplasm but not the nucleus of cells. Deletions within the surrounding sequence Lys-128Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu also produce cytoplasmic large-T and define a region of the protein involved in nuclear location.     

Important amino acid in the hemagglutinin glycoprotein of measles virus (MV) that governs hemadsorption

Two strains of measles virus IMA and SMD that were isolated using B95a cell line show hemadsorption negative. After adaptation to Vero cells, these strains gain the ability to agglutinate AGM-RBC and show hemadsorption positive. Sequence analysis of these two kinds of virus reveals that the two strains all have a Ser (HAD negative) to Gly (HAD positive) mutation at position 546 in the H protein. Site-directed mutagenesis and expression in COS cells were used to confirm that the mutation Ser→Gly is responsible for hemadsorption alteration. Then the monoclonal antibody against CD46 was used to identify that this mutation also governs the binding function of MV H protein to CD46 receptor. The data provide a new important amino acid of MV H protein that governs the hemadsorption and binding to CD46 receptor.     

牛凝乳酶二硫键功能的研究：Cys45的定位突变

以ｐｈａｇｅｍｉｄ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ为载体，把牛凝乳酶原基因的ＫｐｎＩ－ＫｐｎＩ片段插入，将牛凝乳酶４５位Ｃｙｓ用Ａｌａ取代，根据遗传密码子的兼并性，在其附近引入限制性内切酶ＣｌａＩ位点．利用寡聚核苷酸介导的定位突变技术，以获得凝乳酶Ｃｙｓ４５Ａｌａ的突变基因．为了提高突变效率，采用Ｋｕｎｋｅｌ等创立的含尿嘧啶单链ＤＮＡ模板法，经酶切鉴定及双脱氧末端终止法测序，证明已获得预期的突变。     

苹果属观赏海棠新品种‘红禧儿’

【目的】为我国城乡绿化美化提供新植物材料。【方法】海棠新品种‘红禧儿’是1996年利用平邑甜茶种子进行辐射诱变,从后代中选育出的大果突变体。【结果】‘红禧儿’树体高大、树姿开张、花果量大、白蕾白花;幼叶和展开叶均为绿色;果实直径1.9 cm(母本1.3 cm),果实扁圆形,果皮初期绿色,后期转为亮红色,RHS色号:46A,果肉黄色或橙色,落叶后挂果期长。在青岛地区观花期为4月中下旬,11月中下旬落叶,观果期10月中旬至12月中下旬。【结论】‘红禧儿’适应性强,综合观赏价值高。