绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.     

原位还原的金纳米簇抑制β乳球蛋白淀粉样纤维形成

在碱性条件下,以β乳球蛋白(β-LG)为还原剂,直接原位还原氯金酸制备了荧光金纳米簇.通过调控氯金酸的用量,获得了红色和黄色两种荧光金纳米簇,并对其光学性质和形貌进行了表征.进一步,利用荧光光谱、圆二色光谱、动态光散射和透射电子显微镜等分析手段系统考察了这两种金纳米簇对β-LG聚集的抑制作用.研究发现:在这两种体系中,被吸附在金纳米簇表面的β-LG蛋白量不同,导致其对β-LG聚集的抑制作用也不同,即红色荧光金纳米簇可抑制β乳球蛋白聚集生长期,而黄色荧光金纳米簇则可抑制其成核期.     

基于双配体稳定的金纳米簇荧光检测生物硫醇

生物硫醇在生物系统中起着关键的作用,对生物硫醇快速灵敏准确的检测对于一些疾病的临床诊断具有重要意义.提出一种基于双配体稳定的金纳米簇的合成过程用于快速检测生物硫醇的荧光分析方法.以巯基十一烷酸(MUA)和L-丝氨酸(L-Ser)为配体能够快速制备得到荧光金纳米簇,合成的金簇在600 nm处有明显的强荧光发射峰.在金簇的合成过程中,当体系存在生物硫醇时,金簇的荧光会发生猝灭,荧光猝灭的程度与生物硫醇的浓度相关.该检测方法对于半胱氨酸的检测线性范围在8. 3 133. 3μmol/L,检测限为1. 09μmol/L.该分析方法不仅能够快速制备得到荧光金纳米簇,且具有较好的灵敏度和选择性,并将材料制备和目标物分析两个过程相结合,有效缩短了分析时间,提高了检测效率.另外,该方法在人血清中表现出良好的检测结果,说明该检测方法的具有较好的实用性.     

磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测应用

建立了一种基于磁性荧光免疫纳米探针的竞争性免疫分析法并用于检测人免疫球蛋白G(_{Ig G}),蛋白G被用作抗体与磁性纳米团簇定向结合的衔接蛋白.将蛋白质修饰的磁性纳米团簇与荧光猝灭剂(_DABCYL)标记的山羊抗人Ig G偶联,然后与羧基荧光素(_FAM)标记的人Ig G孵育,得到磁性荧光纳米复合免疫探针,最后与目标分析物(人Ig G)孵育,进行竞争性免疫反应.结果表明,抗体的定向连接可以有效避免其抗原活性位点被包覆,而小尺寸的纳米团簇可以起到信号放大作用,从而提高检测灵敏度.该探针检测Ig G的线性范围为0.06～146.00nmol^·L^-1,检测限为0.02nmol·L^-1(S/N=3),其抗干扰能力强,并且能够用于人血清中Ig G的检测.     

金纳米簇高效绿色制备及其对汗潜指印的显现

目的制备性能优良的金纳米簇,构建荧光金纳米簇粉末显现汗潜指印的新方法,并将荧光金纳米簇粉末、金粉、磁性粉对陈旧指印显现效果进行比较,探究新方法的优点与不足。方法基于微波辐射与超声方法的优点,采用超声-微波协同制备方法,以牛血清白蛋白为稳定剂和还原剂绿色合成了金纳米簇,对金纳米簇制备条件进行优化后,将其制成粉末应用于潜指印显现。借助自主搭建汗潜指印显现观察系统,用多波段光源紫外光激发,观察汗潜指印显现效果。结果金纳米簇的制备耗时约1 h,过程高效绿色,荧光性能好,量子产率高达7.1%,平均粒径约为3.3 nm,最佳激发波长为521 nm,最强发射峰为633 nm。其显现的汗潜指印发出橙红色荧光,细节特征明显。结论以超声-微波协同制备方法制备的金纳米簇可应用于模拟案件现场指印的显现观察,其显现效果优于传统粉末显现试剂,是一种快捷、环保的汗潜指印显现方法。     

利用含RGD的多肽增进细胞摄取用于细胞中弗林酶活性的检测

设计并合成了一种新型自组装多肽纳米荧光探针.在合成方法上使用了新型的生物兼容性的CBT-Cys点击反应实现了RGD肽的环化.该探针可通过RGD序列靶向肿瘤细胞αvβ3整合素受体,促进细胞的摄取;同时可与细胞内弗林酶作用导致荧光的"关-开",达到对肿瘤细胞的靶向荧光成像功能.     

基于蛋白包覆金纳米簇的碱性蛋白酶荧光检测

设计开发了一种在碱性条件下由溶菌酶包覆合成并稳定的荧光金纳米簇,并利用它实现对碱性蛋白酶的快速灵敏检测.其检测原理是碱性蛋白酶将包覆和稳定金纳米簇的溶菌酶进行水解,造成金纳米簇的荧光下降.通过关联荧光下降程度与碱性蛋白酶浓度的关系,可实现对碱性蛋白酶的定量检测.考察了金纳米簇与碱性蛋白酶溶液体积比、反应温度和反应时间对检测灵敏性的影响规律.结果表明:在金纳米簇与碱性蛋白酶溶液体积比为1∶9、反应温度为40,℃、反应时间为3,h的条件下,检测效果最好;该检测方法的线性范围可达2~2,000,μg/m L(即酶活检测范围为4×10-5~0.04 unit/m L),检测限为0.1μg/m L(即酶活检测限为2×10-6 unit/m L),且检测的专一性较好,有望应用于实际检测.     

基于单链DNA-银纳米簇荧光探针对微囊藻毒素-LR的检测研究

以单链DNA为模板,制备了单链DNA-银纳米簇(ssDNA-Ag NCs)荧光探针,构建了一种无酶无标记检测微囊藻毒素-LR(microcystin-LR)的荧光传感分析方法.设计的ssDNA既能作为模板合成ssDNA-Ag NCs荧光探针,又能与目标分析物微囊藻毒素-LR通过高亲和性和高特异性结合.采用透射电镜(TE...     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

金属纳米团簇在生物医学领域的研究进展

金属纳米团簇具有独特的超小尺寸和光、磁、催化等性能,以及优异的生物相容性等特征,在生物医学研究中备受关注.但其存在发光效率偏低、活体代谢速度较快等问题.为此介绍近几年通过合成优化和发光调控等方法提高金属纳米团簇的检测与成像灵敏度和肿瘤诊疗能力的研究进展.探究金属纳米团簇的肾代谢和生物酶催化性能;开发具有精确原子数、高效生物相容性和肿瘤靶向性的金属纳米团簇;突破其近红外发光量子产率限制,提高光声-磁共振造影等性能,将是未来该领域研究的重要方向.     

羧基磁流体制备和牛血清白蛋白表面修饰

 磁性纳米粒已被用作肿瘤磁感应热疗的介质，目前常用纳米Fe3O4，其经典制备方法是化学共沉淀法，得到具有超顺磁性的纳米Fe3O4粒径约为10～15nm。本文采用改进的化学共沉淀法制备聚丙烯酸（PAA）修饰的羧基纳米Fe3O4，通过EDC、NHS活化法偶联模型蛋白牛血清白蛋白（BSA），用BCA定量分析磁粒对BSA的偶联效率，并进一步偶联荧光标记的抗体，观察偶联效果。结果表明，改进的化学共沉淀法制备的羧基纳米粒粒径约10nm，水相分散性良好；定量分析和光学观察结果均显示，采用EDC、NHS活化法能使蛋白质与羧基化磁性颗粒稳定结合。本研究为靶向磁性纳米粒的制备提供一种新方法。     

抗EV71多克隆抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒对病毒的特异性富集

 手足口病是幼儿和儿童常见的一种传染病,严重时会引起患者死亡。EV71病毒（人肠道病毒71型）是引起手足口病的一种主要病毒。为寻求一条快速诊断EV71病毒感染的新方法,将兔抗EV71多克隆抗体,通过戊二醛交联法偶联在氨基硅烷修饰的磁性纳米颗粒表面,获得抗EV71多克隆抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒用于EV71病毒的检测。通过酶联免疫、免疫荧光方法证实了抗体耦合在磁性纳米颗粒表面,并通过BCA法测得其耦合的效率为94.1%。采用抗体偶联的磁性纳米颗粒对EV71病毒液中的病毒抗原进行吸附,通过ELISA法检测上清液中病毒含量的变化,并对磁性纳米颗粒表面吸附的病毒进行免疫荧光和核酸PCR检测,证明了抗体偶联的磁性纳米颗粒可以与病毒抗原特异性结合。由于该纳米颗粒同时具有抗体的靶向性和磁性颗粒的磁响应性,对病毒抗原有较好的特异性吸附能力,可以用于低浓度大样本的EV71病毒抗原的富集检测。利用抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒,同时具有可在病毒感染的细胞周围特异性富集和磁颗粒可在交变磁场下感应升温的双重功能,将其作为磁感应热疗的靶向介质,有望研制出病毒感染性疾病磁感应热疗的靶向介质,为靶向热疗病毒感染性疾病提供新的尝试。     

CdS纳米晶标记抗雌二醇抗体荧光免疫分析试剂

在水相中制备了CdS纳米晶,其在536 nm处有较强荧光发射,用巯基乙酸修饰后与抗雌二醇抗体偶联,制备了CdS纳米晶标记的抗雌二醇抗体标记物,该标记物具有良好的荧光特性,发射波长红移至588 nm.利用该标记物竞争免疫分析法测定雌二醇的线性范围为0.20～8.00 mg/L.     

基于DNA-AuNCs的荧光传感新方法灵敏检测胰蛋白酶活性

以DNA模板金纳米簇(DNA-AuNCs)作为荧光探针,发展了一种灵敏检测胰蛋白酶活性的荧光分析新方法.在胰蛋白酶存在条件下,牛血清白蛋白水解成多肽片段,释放出游离的半胱氨酸残基.半胱氨酸残基与金纳米簇通过Au-S键形成非荧光的配合物,导致金纳米簇的荧光强度显著降低.该方法对胰蛋白酶的线性检测范围为0.1～2.0mg/L,检出限为20μg/L(R_(SN)=3).此外,该方法被成功应用于人血清样品中胰蛋白酶含量的测定.     

层状材料负载钌纳米簇及催化性能

通过离子交换与原位还原,实现了钉纳米簇在蒙脱石层间的负载.采用X射线衍射,透射电镜,X射线荧光分析多种手段对所制备的负载催化剂的结构、形貌和钌纳米簇负载量进行了表征;以硼氢化钠和水反应作为探针反应,考察了负载钉纳米簇对硼氢化钠水解产氢的催化性能.结果表明:钌纳米簇成功被引入蒙脱石的层间,插层后的钌纳米簇粉体分散度高,平...     

转铁蛋白偶联荧光纳米钻石靶向体系的制备及HeLa细胞吸收机制研究

以荧光纳米钻石(FND)作为药物载体和探针,转铁蛋白(Tf)作为靶向配体,聚赖氨酸(PL)做桥梁,制备了荧光纳米钻石-聚赖氨酸-转铁蛋白(FND-PL-Tf)靶向纳米颗粒;以人宫颈癌细胞(HeLa cells)为体外模型,研究靶向纳米颗粒与细胞的作用,探讨细胞摄取纳米颗粒的转运机制,为纳米颗粒靶向输送药物和肿瘤检测提供有价值的理论依据。结果表明细胞摄取FND-PL-Tf纳米颗粒的数量与颗粒浓度、时间及纳米颗粒表面偶联转铁蛋白量有关;由物理吸附或共价偶联Tf获得的FND-PL-Tf纳米颗粒均为网格蛋白决定、转铁蛋白受体介导机制进入细胞。这些研究表明FND-PL-Tf纳米颗粒具有潜在的靶向输送药物和肿瘤靶向检测功能。     

抗CEACAM5纳米抗体在大肠杆菌中的高效周质表达

纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强以及能够穿过血脑屏障等众多优势,而且其能够通过大肠杆菌、酵母等简单微生物大量表达。大肠杆菌周质表达纳米抗体是目前纳米抗体制备主要的方法之一,但是纳米抗体的表达水平还相对较低。以pET22b和pMES4为载体构建了两种重组表达质粒,并且比较了他们在不同宿主菌中表达纳米抗体的情况。结果表明,以pMES4为载体的大肠杆菌能够在周质中可溶性表达纳米抗体,而以pET22b为载体的大肠杆菌表达的纳米抗体无法分泌到周质空间中。随后,通过IPTG浓度优化及5 L发酵罐过程,控制实现了纳米抗体在大肠杆菌周质中的表达量达到308. 32 mg/L。研究提供了一种高效表达纳米抗体的方法,为纳米抗体的规模化制备奠定了技术基础。     

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础。使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库。采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性。通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10mol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性。利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗。     

羊毛角蛋白基金纳米团簇的制备及其打印成像的应用

利用羊毛角蛋白作为还原剂和稳定剂合成金纳米团簇溶液,通过可见光和紫外光的对比图像以及荧光光谱对pH值、反应温度和反应时间3个影响因素进行分析,确定金纳米团簇合成的最优方案。采用透射电子显微镜观察金纳米团簇的尺寸及分布,并将羊毛角蛋白基金纳米团簇用作打印墨水绘制荧光图案。试验结果表明:羊毛角蛋白和氯金酸的混合溶液调节为碱性(即NaOH浓度为1mol/L)、温度为37℃、反应时间为12h条件下所制备的羊毛角蛋白基金纳米团簇溶液在690nm处发射强烈荧光,所得的金纳米团簇颗粒的尺寸约为2.5nm且均匀分布,制得的打印墨水可以获得清晰的荧光图像。     

基于谷胱甘肽稳定铜纳米簇的荧光传感方法灵敏检测汞离子

以谷胱甘肽(GSH)为保护配体和还原剂,制备了稳定的水溶性荧光铜纳米簇(CuNCs).所合成的铜纳米簇在590nm处发射出红色荧光,量子产率约为2.3%,具有良好的光稳定性.以谷胱甘肽稳定铜纳米簇(GSH-CuNCs)作为信号探针,报道了一种荧光传感新方法用于灵敏检测Hg~(2+).结果表明,Hg~(2+)的线性检测范围为2.0×10~(-8)～2.0×10~(-6) mol/L,检出限为4.0×10~(-9) mol/L(R_(SN)=3).该方法成功地实现了湖水样品中汞离子的检测,为汞离子的快速和灵敏监测提供了一种新途径.