高毒效杀蚜球孢白僵菌菌株筛选

试验研究球孢白僵菌Beauveria bassiana4菌株“Bb7001”、“Bb7004”、“Bb8001”、“Bb4014”在21℃下对桃蚜Myzus persicae(Sulzer)的侵染致病力及对桃蚜生殖力和种群参数的影响,结果表明:在21℃下,球孢白僵菌对桃蚜的侵染致病力和对其生殖力及种群参数的影响在总体上基本一致,但三者在4菌株间也有一定差异,强弱依次为“Bb7001”>“Bb7004”>“Bb4014”>“Bb8001”;桃蚜接种不同浓度4菌株后在第3~5d达到死亡高峰期,lgLC50分别为3.67、4.34,4.52和4.48;接种球孢白僵菌4菌株106(孢子)/mL后,桃蚜成蚜的生殖力在第3d均与对照组桃蚜生殖力有显著差异,10d内日均产仔与对照蚜相比下降30.06%~50.00%;球孢白僵菌4菌株对桃蚜净生殖力有极显著降低作用,对内禀增长力也有一定的降低作用,接种4菌株后桃蚜净生殖力下降61.90%~72.73%,内禀增长力降低13.04%~41.58%,但对世代历期几乎没有影响。菌株“Bb7001”显示了较高的杀蚜毒效,可考虑作为防治桃蚜的首选菌株进行开发。     

白僵菌抗多菌灵突变株的诱变及生物学特性研究

采用菌丝生长速率法测定了球孢白僵菌对多菌灵的敏感性和最低完全抑制浓度(MIC)。结果显示,在供试的球孢白僵菌菌株中,Bb06菌株对多菌灵最敏感,其EC₅₀值为1.0688μg/ml,多菌灵对球孢白僵菌菌丝生长的MIC为9μg/ml。通过菌丝块诱变法和分生孢子诱变法获得球孢白僵菌抗多菌灵突变株,并测定球孢白僵菌不同抗性突变株对多菌灵的抗性水平。结果表明,在抗性突变株中,BC-4菌株的EC₅₀值最大,为258.7711,对多菌灵的抗性水平最高,达到242.11;BC-3菌株的EC₅₀值最小,为18.6311,抗性水平最低。同时对球孢白僵菌抗多菌灵突变株的菌丝生长速率和产孢能力差异的研究表明,Bb06菌株(亲本菌株)的生长速率最大,为1.78mm/d,BC-8菌株的生长速率最小,为1.41mm/d。球孢白僵菌不同抗性突变株的产孢能力均比对照敏感菌株强,但不同菌株间存在一定差异,在抗性突变株中,BC-4菌株的分生孢子产生量最大。     

球孢白僵菌高毒菌株筛选模型的研究

研究表明,来源不同的球孢白僵菌菌株生物学性状具有多样性。相同或不同寄主分离株在毒力,产孢量对数,萌发中时,水分活率,紫外照射活率,水浴活率,生长曲线斜度等方面均具显著或极显著的差异。经逐步剔除的通径分析,得到与毒力呈显著性负相关的指标,产孢量对数和水分活经,剔除因子的贡献率仅为３．６７％。所得回归方程：ｙ＝７６．７９１９－９．４９３７ｘ１＋０．００６１２ｘ２回归显著,可作为白僵菌高毒菌株的筛选模型     

重组球孢白僵菌表达目标产物类枯草杆菌蛋白酶的发酵特性研究

采用单因子筛选和正交试验,研究了碳源、氮源、微量元素及无机盐等营养成分对重组球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb0062-15-4-CDEP-1产生目标产物类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的影响,并通过摇瓶发酵和30 L发酵罐发酵对其发酵特性进行了研究.结果表明,其优化发酵培养基为2.0%玉米粉,1.0%麦麸,0.25%豆粕粉,0.4%NaNO3,0.1%MgSO4·7H2O.摇瓶发酵结果表明,在对数生长期,随着菌体生物量的增加,CDEP-1产量上升,二者呈一定的平行关系;当菌体生长到稳定期,CDEP-1产量继续上升,并达到产酶高峰;此后,随着菌体生长的衰退,CDEP-1产量出现快速下降趋势.扩大培养时,30 L发酵罐中60 h产酶量最高,比摇瓶培养(168 h)缩短了108 h,单位体积的产酶量比摇瓶培养提高80%.结果对研究和利用该球孢白僵菌重组菌株的代谢产物,提高真菌杀虫剂的杀虫效果奠定了基础.     

玫烟色拟青霉对小菜蛾幼虫的侵染过程及接菌方法对其致病力的影响

采用扫描电镜观察玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)分生孢子在小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫体表的萌发和侵染过程及玫烟色拟青霉孢子粉、孢子悬浮液和孢子培养液对小菜蛾幼虫的致病力.结果表明:小菜蛾幼虫体表嵴状突起结构区附着的孢子较多, 刺状突起结构区附着的孢子较少;刺状突起结构区附着的孢子萌发较早, 多数孢子在接菌后16 h开始萌发, 而嵴状突起结构区附着的孢子多数在20 h开始萌发, 在平缓结构区孢子萌发最迟.在嵴状突起结构区和刺状突起结构区, 多数孢子萌发后产生芽管, 直接以芽管侵入幼虫体壁, 少数形成附着胞侵染寄主.此外玫烟色拟青霉3种不同接菌方法对小菜蛾幼虫的侵染速率和致病力大小明显不同, 其中孢子培养液比孢子悬浮液和孢子粉对小菜蛾幼虫的侵染速率快, 接菌44 h虫体表现出明显的感病症状, 致死中时为3.18 d;孢子悬浮液和孢子粉处理的小菜蛾幼虫, 60 h虫体出现感病症状, 致死中时分别为4.20 d和4.34 d;而且致病力大小也存在明显差异, 接孢子粉的处理明显高于孢子悬浮液和孢子培养液, 小菜蛾幼虫6 d的死亡率达76.2%, 而其他两种处理小菜蛾幼虫6 d的死亡率仅为59.8%和58.5%.本研究结果表明, 小菜蛾幼虫的体表结构影响玫烟色拟青霉孢子在寄主体表的附着、萌发和侵入, 玫烟色拟青霉孢子粉对小菜蛾幼虫的致病力最强, 明显高于孢子悬浮液和孢子培养液.     

农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选

以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)YB-06为受体菌株, 采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(pATMT1)介导的球孢白僵菌的遗传转化,并研究了转化介质和pH对转化效率的影响。结果表明:在采用28℃、200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌浓度OD₆₀₀=0.8、孢子浓度为1×106个/ml、pH5.1~5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH5.3时,转化效率最高,达586个转化子/106分生孢子;不同共转化介质对转化效率影响明显, 玻璃纸和硝酸纤维素膜转化效率较高。对3000个转化子生长速度和产孢量等性状分析获得46个性状特异突变体。本文结果为进一步研究球孢白僵菌的生长发育、致病机理和毒力相关基因功能奠定了基础。     

玫烟色拟青霉对小菜蛾幼虫的侵染过程及接菌方法对其致病力的影响

采用扫描电镜观察玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）分生孢子在小菜蛾（Plutella xylostella）幼虫体表的萌发和侵染过程及玫烟色拟青霉孢子粉、孢子悬浮液和孢子培养液对小菜蛾幼虫的致病力。结果表明：小菜蛾幼虫体表嵴状突起结构区附着的孢子较多, 刺状突起结构区附着的孢子较少;刺状突起结构区附着的孢子萌发较早, 多数孢子在接菌后16 h开始萌发, 而嵴状突起结构区附着的孢子多数在20 h开始萌发, 在平缓结构区孢子萌发最迟。在嵴状突起结构区和刺状突起结构区, 多数孢子萌发后产生芽管, 直接以芽管侵入幼虫体壁, 少数形成附着胞侵染寄主。此外玫烟色拟青霉3种不同接菌方法对小菜蛾幼虫的侵染速率和致病力大小明显不同, 其中孢子培养液比孢子悬浮液和孢子粉对小菜蛾幼虫的侵染速率快, 接菌44 h虫体表现出明显的感病症状, 致死中时为3.18 d;孢子悬浮液和孢子粉处理的小菜蛾幼虫, 60 h虫体出现感病症状, 致死中时分别为4.20 d和4.34 d;而且致病力大小也存在明显差异, 接孢子粉的处理明显高于孢子悬浮液和孢子培养液, 小菜蛾幼虫6 d的死亡率达76.2%, 而其他两种处理小菜蛾幼虫6 d的死亡率仅为59.8%和58.5%。本研究结果表明, 小菜蛾幼虫的体表结构影响玫烟色拟青霉孢子在寄主体表的附着、萌发和侵入, 玫烟色拟青霉孢子粉对小菜蛾幼虫的致病力最强, 明显高于孢子悬浮液和孢子培养液。     

辐照木霉菌株的生物学效应研究

本文研究了6 0 Coγ射线辐照木霉 (Trichodermaspp)菌株的诱变效果。结果表明 :在γ射线的作用下 ,木霉分生孢子萌发率显著降低 ,孢子萌发时间加长 ,部分萌发孢子菌丝生长畸形 ;随着照射剂量的增加 ,木霉孢子存活率急剧下降 ,剂量效应曲线符合一次击中模型S =e-λD;诱变效应方程为 :Y =-0 940e1 2 9x,r=0 953 3 (r0 0 1=0 765)。依各菌株对生长速度、产孢量、开始产孢时间、菌落颜色等变异情况 ,初筛得到变异菌株 1 3 0株。     

绿色产色链霉菌E-219菌落的形态分化

菌株E-219由原始菌株CGMCC4.1119经60Coγ诱变及原生质体融合等手段改造后所得,本文通过分子荧光探针、荧光显微镜和电镜对绿色产色链霉菌E-219在固体基质表面的发育分化周期、斜面培养时间对阿维拉霉素产量的影响进行了研究,以为工业发酵选择适当的斜面种子提供理论依据。试验表明该菌株菌落发育过程伴有间断性菌丝凋亡,分生孢子的产生是活性菌丝分化的结果。与原始菌株相比该菌落形态呈现显著不同,其孢子萌发形成杂色初生菌丝,基内菌丝出现二次死亡(48h)及其中活性菌丝片段的二次快速生长,分生孢子形成数量多。原始菌株呈螺旋状孢子丝,孢子表面带刺,而E-219为直线型孢子丝,分生孢子表面光滑无刺突。摇瓶试验表明,菌种斜面种龄以106h左右为宜,此时分生孢子活性高,阿维拉霉素发酵单位可达1200mg/L。     

蓖麻叶片粗提物对黄瓜瓜绢螟的作用

为了测定蓖麻对瓜绢螟的作用,也为黄瓜害虫无公害控制提供新的手段,用不同浓度的蓖麻叶片粗提物处理黄瓜叶片,测定瓜绢螟取食量、存活率及体内解毒酶活性的变化。结果显示,蓖麻叶片粗提物对瓜绢螟的取食和存活有明显的抑制作用,处理浓度越大,取食量和存活率越小。如用稀释200倍的蓖麻叶片粗提液处理黄瓜叶片,瓜绢螟的取食面积(1.89 cm2)仅为对照(3.51 cm2)的53.7%,存活率为对照的2.3%;600倍浸提液处理的瓜绢螟取食面积(3.43 cm2)为对照的97.7%,存活率为对照的51.4%。瓜绢螟幼虫虫龄对粗提物的作用有明显影响,粗提物对低龄幼虫的作用明显强于高龄幼虫,200倍液处理24 h后,1龄幼虫的存活率(22.22%)仅为5龄幼虫(66.67%)的33.33%。不同剂量蓖麻叶片粗提物处理后,瓜绢螟体内的谷胱甘肽转移酶、羧酸脂酶、多功能氧化酶等解毒酶活性迅速上升,随着处理剂量的增加,解毒酶的活性上升幅度增大。取食用稀释200倍的蓖麻粗提液处理的黄瓜叶片24 h后,1龄幼虫和5龄幼虫体内谷胱甘肽转移酶活性分别较对照高23.79%和78.02%,羧酸脂酶活性分别较对照高72.42%和23.84%,多功能氧化酶活性分别较对照高100.58%和122.39%。结果表明,蓖麻叶片粗提物对瓜绢螟有明显的拒食和毒杀作用。     

球孢白僵菌基因组候选效应子的预测与分析

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种广泛应用的生防菌株,效应子在其对寄主昆虫侵染过程中发挥着重要作用。为高通量地筛选球孢白僵菌的效应子,本研究根据球孢白僵菌全基因组信息,利用SignalP、TMHMM、TargetP和Protcomp等生物信息学软件和预测程序对球孢白僵菌中10 364个蛋白序列进行分泌蛋白预测。结果表明,共分析到940个分泌蛋白,包含了185个碳水化合物活性酶家族蛋白。其中碳水化合物结合模块(CBM)40个,碳水化合物酯酶(CE)23个,糖苷水解酶(GH)92个,糖基转移酶(GT)4个,多糖裂解酶(PL)2个,辅助功能酶(AA)24个。进一步将上述分泌蛋白与胞外酶数据库进行比对分析、半胱氨酸含量分析、多个串联重复序列分析、病原寄主互作数据库进行比对及剔除大于300个氨基酸序列的蛋白,共获得18个候选效应子,其中11个为功能未知的假定蛋白,其余为胞外蛋白、细胞壁蛋白、几丁质酶蛋白等。本研究结果为进一步探究效应子在病原菌与昆虫寄主中的互作奠定了理论基础,并为其他病原菌效应子的预测及分析提供了技术参考。     

化感水稻内生真菌发酵产物的抑菌活性评价及其对水稻保护性酶活性的影响

为探究化感水稻内生真菌对植物病原真菌的抑制作用及其对水稻生理特性的影响,本研究采用来自化感水稻6173中分离得到的12株内生真菌菌株,以水稻纹枯病、稻瘟病、恶苗病菌为指示菌株,通过平板对峙法研究了内生真菌菌株的抑菌活性,再采用牛津杯扩散法对初筛获得的抗性菌株进行抑菌活性复筛,并对筛选到的抑菌菌株抗菌物质的热稳定性及其对非化感水稻93067相关保护性酶活性的影响进行了研究。结果表明,菌株REF-04抑菌活性强,其对纹枯病菌抑制率达到50.63%,发酵液乙酸乙酯提取物抑制效果显著,抑菌圈直径达到18.6 mm;菌株REF-04发酵液乙酸乙酯提取物中抗菌成分具有较强的热稳定性,其发酵液能显著提高水稻苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性。本研究筛选获得的水稻内生真菌REF-04具有较好的抗菌活性,同时还能促进水稻幼苗保护性酶活性的提高,其作为生物农药具有一定的应用价值和开发前景。     

甘薯长喙壳侵染对甘薯块根抗氧化酶活性的影响

以易感黑斑病甘薯品种“徐薯18”为试验材料, 分别接种分离自石榴、甘薯和芋头的甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata), 研究其保护酶活性及丙二醛(MDA)含量变化。结果显示, 非亲和性菌株[分离自石榴的甘薯长喙壳(CQS2)和分离自芋头的甘薯长喙壳(YP1)]和亲和性菌株[分离自甘薯的甘薯长喙壳(SP1)]接种的甘薯块根苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性, 与对照处理相比均有升高, 且接种CQS2 和YP1 的处理始终高于接种SP1 的处理; 非亲和性菌株和亲和性菌株接种的甘薯块根MDA 含量均呈先上升后下降趋势, 且接种CQS2 和YP1 的处理在接种25 h 时MDA 含量明显高于接种SP1 的处理, 接种SP1 的处理在接种后期(50 h)的MDA 含量降至与对照相当水平。由此表明: 不同寄主的甘薯长喙壳侵染甘薯块根后, 非亲和性接种菌株(CQS2 和YP1)比亲和性接种菌株(SP1)能增强POD、SOD和CAT 酶活性及诱导较多的MDA, 从而增强病原菌侵染的抗性。     

灵芝栽培病原真菌的鉴定及异硫氰酸烯丙酯对其抑制效果的研究

为了探究灵芝段木栽培过程中杂菌侵染的主要病原真菌组成及其防控措施,首先对发病灵芝段木及灵芝子实体的病原菌进行分离纯化,采用形态学和rDNA-ITS序列分析进行鉴定,然后研究分离菌株的生物学特性以及异硫氰酸烯丙酯对分离病原菌的抑制效果。结果表明,分离获得的4株病原真菌菌株,其中OTA为黄曲霉(Aspergillus flavus),OTB和OTD为青霉菌(Penicillium infrabuccalum),OTC为木霉菌(Trichoderma sp.)。4株病原菌在PDA培养基生长良好,适宜温度为25~30℃;菌株OTA和OTB的最适碳源分别为木糖和葡萄糖,菌株OTC和OTD的最适碳源为果糖和蔗糖;菌株OTA和OTB的最适氮源分别为牛肉膏和尿素,菌株OTC和OTD的最适氮源为NaNO₃和蛋白胨;菌株OTB、OTC和OTD在酸性条件生长较好,而pH值对菌株OTA的生长影响较小。异硫氰酸烯丙酯对菌株OTA、OTB、OTC和OTD菌丝的生长具有良好的抑制作用,当异硫氰酸烯丙酯浓度为20 μL·L^-1时,其对4株菌株的抑制率均超过97%,可作为安全的防霉剂用于灵芝栽培过程中霉菌污染的防治。本研究结果为灵芝栽培或采后真菌病害的防控提供了理论基础。     

一株黄曲霉拮抗菌的筛选、鉴定及特性研究

为获得拮抗黄曲霉和降解黄曲霉毒素的生物防治菌株,以烟台黄曲霉污染区域土壤为材料,采用稀释分离法和琼脂扩散法,筛选到一株对黄曲霉有抑制作用且可降解黄曲霉毒素的菌株Y-17-3。根据菌株的形态学特征、生理生化试验结合16S rDNA基因序列分析和系统发育树构建,确定菌株 Y-17-3 为空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)。该菌株发酵液经硫酸铵沉淀的抗菌活性及稳定性试验,发现70%饱和硫酸铵沉淀的蛋白粗提物抑制黄曲霉活性最强,可降低黄曲霉孢子的萌发率,抑制菌丝的生长和菌丝球的形成,且该蛋白粗提物对温度、pH值和蛋白酶敏感。菌株Y-17-3能够降解黄曲霉毒素B₁,培养6 d时的降解率达90%。综上,所分离的空气芽孢杆菌Y-17-3菌株能够通过产生拮抗蛋白来抑制黄曲霉生长,且具有较强的黄曲霉毒素降解能力,在农业生物防治领域具有一定的应用前景。     

壳聚糖酶解产物抑制真菌活性研究

为探究并提高壳聚糖抑制真菌的活性,本研究利用蜡状芽孢杆菌ncps116发酵所制备的壳聚糖酶来酶解壳聚糖,测定不同酶解时间壳聚糖产物的抑菌活性,并监测酶解产物中还原糖的含量;之后选取抑菌活性提高最显著的壳聚糖酶解产物为研究对象,测定最低抑菌活性和最适pH,并使用电子显微镜观察酶解产物对病原真菌菌丝和孢子萌发的抑制作用。结果表明,壳聚糖经0.5~12 h酶解能够显著提高市售壳聚糖的抑菌活性,在酶解24 h内抑菌活性呈先升高后降低的趋势,而且酶解产物的抑菌活性与还原糖浓度相关,还原糖浓度过低(≤44.24 μg·mL^-1),酶解不充分,抑菌圈直径13 mm;而还原糖浓度过高(≥1 900 μg·mL^-1),酶解完全,抑菌圈直径10 mm,抑菌活性均较差。其中,酶解6 h的壳聚糖产物抑菌活性提高最显著,对3种病原真菌(棉花黄萎病菌、苹果轮纹病菌、西瓜专化型尖孢镰刀菌)的最低抑菌活性提高4~8倍,还原糖浓度为383.34 μg·mL^-1,在pH值4.0~4.7时抑菌活性最高;此外,酶解产物能导致真菌菌丝断裂、褶皱、菌丝末端囊泡等畸形生长,并长期抑制孢子生长和菌丝伸长。综上所述,酶解是提高壳聚糖抗菌活性的有效手段,这为推进亮聚糖在防腐保鲜方面的应用奠定了基础。     

利用aiiA基因筛选抗烟草青枯病生防菌株及其鉴定

为了有效筛选出对作物青枯病具有防治效果的生防细菌,本研究采用群体感应淬灭基因aiiA的简并引物进行PCR扩增与室内盆栽防治效果测定相结合的方法进行生防细菌的筛选,并通过传统的细菌学鉴定方法和分子生物学手段明确其分类地位。结果表明,从253株生防菌株中获得了12株含有aiiA基因的生防菌株;进一步盆钵防效测定,获得了一株对烟草青枯病具有较好防治效果的生防菌株B15。该菌株接种处理后,烟草青枯病可推迟2 d 发生,在接种处理14 d后其对烟草青枯病防治效果为68.33%。B15菌株在NA平板培养基上菌落呈圆形、白色、表面有光泽且粗糙,菌体杆状,革兰氏染色阳性,耐盐性为7%;生理生化测定、16S rDNA和gyrB基因序列分析表明,菌株B15为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。本研究获得的含有群体感应淬灭基因aiiA的蜡样芽胞杆菌B15菌株,为作物青枯病生物防治提供了新的生防菌株资源。     

丁香精油对甜樱桃采后优势致腐真菌的控制及其抑菌机理

为探明植物精油对甜樱桃采后优势致病菌的抑菌效力及抑菌机理,以山东泰安地区主栽品种红灯为试验材料,从自然腐烂的甜樱桃果实上分离纯化优势致病菌,采用形态学方法并结合ITS序列法进行鉴定,选用丁香精油从体外熏蒸和接触2种作用方式研究其对主要病原真菌的抑菌效果。结果表明,甜樱桃采后的3种主要致腐真菌分别为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides);体外抑菌试验表明,一定浓度的丁香精油能显著抑制3种致病菌的菌丝生长和孢子萌发,熏蒸处理较接触效果更好,对B. cinerea、 A. alternata和C. gloeosporioides的最小抑菌浓度(MIC)分别为120、100和100 μL·L^-1;试验还表明丁香精油破坏了菌丝形态,其抑菌机理可能与精油疏水性造成的微生物膜系统结构破坏、及胞内主要内容物流失有关。综上所述,丁香精油作为甜樱桃贮藏前的熏蒸剂具有较好的应用潜力。     

菌根真菌对3种兰花幼苗生长作用研究

菌根真菌在兰科植物生活史中具有重要作用。为获得促进兰科植物生长的共生真菌,阐明菌根真菌对兰科植物的作用,本研究对从野生建兰中分离获得的3株共生真菌进行形态学和系统进化分析,并将3株真菌与建兰、硬叶兰和铁皮石斛幼苗在不同浓度燕麦琼脂培养基(OMA)条件下共培养,进行比较研究。结果表明,3株真菌分属于胶膜菌属(Tsc)、角担菌属(Cej3)和蜡壳菌属(Sec),且菌丝和菌落特征存在明显差异;系统进化分析发现,Tsc菌株与Cej3菌株亲缘关系较近,与Sec菌株亲缘关系较远;与兰科植物共培养结果表明,Tsc菌株可在全部OMA浓度条件下与3种兰科植物幼苗建立共生关系,且定殖率均为100%;Cej3菌株和Sec菌株与3种兰科植物在不同OMA浓度条件下定殖时间及定殖率存在差异,且具有一定的专一性;与对照组相比,与真菌共生的兰科植物幼苗的平均鲜重、干重、苗高、根长增长率均明显提高。本研究结果为深入研究兰科植物与真菌共生的分子机制奠定了一定的理论基础,并为兰花种质资源的保护提供了参考。