以藻酸钙为载体的可注射性组织工程软骨和骨研究

目的在裸鼠背部皮下注射软骨细胞/藻酸钙复合物、骨髓基质成骨细胞/藻酸钙复合物,观察体内软骨、骨形成的可行性。方法分别从兔耳软骨和髂骨获取软骨细胞和骨髓基质干细胞,体外扩增培养,将获得的软骨细胞和骨髓基质成骨细胞与藻酸盐复合,注射于裸鼠背部皮下,以单纯藻酸钙植入作为对照组,6,12周后进行组织学检查和X线检查,观察软骨和骨的形成。结果注射软骨细胞复合物组,裸鼠背部皮下有软骨样组织形成,软骨细胞位于类似于正常软骨组织的陷窝中,注射骨髓基质成骨细胞复合物组,裸鼠背部皮下有骨样组织形成,具有骨髓腔样结构,而对照组无软骨或骨形成。结论藻酸钙可用作软骨和骨组织工程的支架材料,以藻酸钙为载体的可注射性组织工程软骨和骨是可行的。     

可注射性组织工程骨的研究

目的 已经有实验证明可用组织工程方法构建可注射性软骨，试图应用组织工程技术探索可注射性组织工程骨折的可行性。方法 从兔髂骨骨髓细胞中获取骨髓基质成骨细胞，将骨须基质成骨细胞与2.0%藻酸钠溶液混合形成骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物，使细胞的终浓度为5&;#215;10^6/ml。将骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物注射于裸鼠背部皮下，用氯化钙固化为凝胶体。结果 注射后4，8周流向物在裸鼠背部皮下形成硬结节，X线片均显示有明显成骨现象。组织学分析显示标本有大量新骨形成，并具有髓腔样结构。结论 应用藻酸钠复合骨髓基质成骨细胞可通过注射方式在动物体内形成骨组织。     

可注射性组织工程骨的研究

目的已经有实验证明可用组织工程方法构建可注射性软骨,试图应用组织工程技术探索可注射性组织工程骨的可行性。方法从兔髂骨骨髓细胞中获取骨髓基质成骨细胞,将骨须基质成骨细胞与2.0%藻酸钠溶液混合形成骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物,使细胞的终浓度为5×106/ml。将骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物注射于裸鼠背部皮下,用氯化钙固化为凝胶体。结果注射后4,8周注射物在裸鼠背部皮下形成硬结节,X线片均显示有明显成骨现象。组织学分析显示标本有大量新骨形成,并具有髓腔样结构。结论应用藻酸钠复合骨髓基质成骨细胞可通过注射方式在动物体内形成骨组织。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨及软骨的实验

背景：软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料，保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础。目的：对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察。设计：细胞形态对比，观察12周实验结果。单位：郑州大学骨科研究所，上海第二医科大学骨科实验室。对象：实验于2001—09／2002—06在上海第二医科大学骨科实验室完成。3月龄雄性新西兰大白兔9只，平均体质量3．2kg。方法：复合材料分别为：①藻酸钙。②藻酸钙＋骨髓基质细胞。③藻酸钙＋骨髓基质细胞＋类胰岛素生长因子Ⅰ。④藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β。⑤藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ。将5种组合注射于同一个体新西兰火白兔背部不同部位皮下组织中，每组各注射2处，共10处，每处0.2mL，分别做好标记。按组分别于术后4，8，12周取材，各时间点处死动物3只，取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察，应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术。主要观察指标：兔背部皮下增殖物的组织学观察。结果：兔背部皮下增殖物的组织学观察结果：4周时可见藻酸钙＋骨髓基质细胞＋类胰岛素生长因子Ⅰ、藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β、藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ组有岛状软骨样组织形成，软骨细胞包绕于碱性基质中，8周时复合物中形成大量的类软骨结构，并部分向骨组织转化，细胞周围有大量的基质分泌，部分软骨细胞呈簇状分布。12周时藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ组软骨组织基本转变为骨组织，并开始吸收。结论：骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织。藻酸钙适合骨髓基质细胞生长，是一种良好的骨及软骨组织工程载体。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨及软骨的实验

背景软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料,保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础.目的对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察.设计细胞形态对比,观察12周实验结果.单位郑州大学骨科研究所,上海第二医科大学骨科实验室.对象实验于2001-09/2002-06在上海第二医科大学骨科实验室完成.3月龄雄性新西兰大白兔9只,平均体质量3.2kg.方法复合材料分别为①藻酸钙.②藻酸钙+骨髓基质细胞.③藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子Ⅰ.④藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β.⑤藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ.将5种组合注射于同一个体新西兰大白兔背部不同部位皮下组织中,每组各注射2处,共10处,每处0.2mL,分别做好标记.按组分别于术后4,8,12周取材,各时间点处死动物3只,取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察,应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术.主要观察指标兔背部皮下增殖物的组织学观察.结果兔背部皮下增殖物的组织学观察结果4周时可见藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子Ⅰ、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ组有岛状软骨样组织形成,软骨细胞包绕于碱性基质中,8周时复合物中形成大量的类软骨结构,并部分向骨组织转化,细胞周围有大量的基质分泌,部分软骨细胞呈簇状分布.12周时藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ组软骨组织基本转变为骨组织,并开始吸收.结论骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织.藻酸钙适合骨髓基质细胞生长,是一种良好的骨及软骨组织工程载体.     

微球化人脐带 Wharton 胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨简

背景：软骨细胞外基质具有众多的信号分子蛋白和因子,其成分和特性最接近天然软骨组织,因而其很可能是构建组织工程软骨的最理想原料。 目的：探讨海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球复合人脐带Wharton胶间充质干细胞在裸鼠皮下异位构建组织工程软骨的可行性。 方法：制备软骨细胞外基质微丝悬液,将人脐带Wharton胶间充质干细胞接种于海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球中体外培养后植入裸鼠背部皮下（实验组）,以人脐带 Wharton 胶间充质干细胞混合于单纯藻酸盐凝胶微球作为对照组,于4周后取材进行大体和组织学苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化观察。结果与结论：体外培养时微球中干细胞呈球形软骨细胞样形态,生长、增殖情况良好;实验组术后第4周取材可见外形呈类软骨样组织块,甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,镜下观察可见大量类软骨样细胞及类软骨陷窝样结构,植入的混合凝胶微球周围组织无明显炎症反应;对照组显示微球部分降解,周围仅有少量炎症细胞及淋巴细胞。结果可见海藻酸钙-软骨细胞外基质具有良好的组织相容性,复合干细胞形成的微球植入裸鼠皮下可以构建为类软骨样组织。     

复合成骨细胞藻酸盐凝胶的体内成骨效应

目的：为使骨缺损的治疗简便可行，又要保证可靠的骨修复效果，实验将成骨细胞复合于藻酸钙水凝胶中，直接经皮注射动物体内了解其成骨情况。方法：实验于2006—01／2007—07在十堰市太和医院生命科学研究所实验室完成。将培养的兔骨髓基质成骨细胞复合于1．5％藻酸钠溶液，再加入葡萄糖酸钙，制备成骨细胞密度为1×10^10L^-1、钙离子浓度为50mmol／L的藻酸钙水凝胶。将20只健康成年新西兰大白兔左侧背部经皮注射成骨细胞-藻酸钙水凝胶复合物（实验侧），右侧注射单纯藻酸钙水凝胶（对照侧）。于术后4，8，12周分别行X射线检查及组织学观察成骨情况。结果：20只健康成年新西兰大白兔均进入结果分析。X射线和组织学观察表明，实验侧成骨活跃．骨再生迅速．12周内，新生骨组织明显增多，且新生骨组织趋向成熟，X线片显示高密度影；而对照侧未见骨组织出现。结论：复合成骨细胞的藻酸钙凝胶经皮注射植入在动物体内异位成骨可靠、确切。     

聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物／氧化异丙烯F-127复合支架构建人组织工程软骨

目的：探讨聚羟基丁酸酯一聚羟基己酸酯共聚物／氧化异丙烯F-127复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法：实验于2004-09／2005-04在中国医科大学整形外科医院外耳整形与再造中心完成。①选取4周龄无胸腺雄性裸鼠8只，左侧背部皮下为软骨细胞-支架复合物组，右侧背部皮下为单纯支架对照组。人软骨细胞来源于中国医科大学整形外科医院外耳整形与再造中心临床小耳畸形患者行肋软骨移植时剩余的边脚料分离软骨细胞。聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物泡沫材料由清华大学化工系提供，1．0cm&;#215;1．0cm&;#215;0．3cm大小，环氧乙烷消毒后备用。（砻消化、分离、培养人肋软骨细胞，将第3代细胞制成悬液，细胞浓度为5&;#215;10^10L^-1。取mL软骨细胞悬液与少量30％氧化异丙烯FM27溶液（4℃）均匀混合后接种至聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物支架上，形成细胞-生物材料复合物，体外培养1周后植入软骨细胞-支架复合物组，单纯支架对照组植入单纯聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物／氧化异丙烯F-127复合支架。（3）术后12周取材，行大体观察。利用苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、阿尔辛蓝-丽春红染色对再生的软骨组织进行组织学检测。结果：实验选取4周龄无胸腺雄性裸鼠8只，全部进入结果分析。①术后12周大体标本观察结果：软骨细胞-支架复合物组形成了与支架形态相同的乳白色类似软骨样组织，表面光滑有弹性。单纯支架对照组呈褐色，质地较软。②再生的软骨组织术后12周组织学检查结果；组织学检查证实软骨细胞-支架复合物组有软骨细胞存在，并且有基质分泌。单纯支架对照组无新生软骨组织形成。结论：利用聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物／氧化异丙烯F-127复合支架可在裸鼠体内形成人组织工程化软骨。     

关节软骨细胞复合胶原海绵异位构建组织工程化软骨组织的可能性

目的：观察兔关节软骨细胞与胶原海绵在体外复合培养以及体内植入后异位成软骨情况。方法：采用酶消化法分离、培养幼兔关节软骨细胞，取第三代细胞以3&;#215;10^7/ml密度均匀接种于胶原海绵中，分别通过倒置显向镜和扫描电镜观察软骨细胞在载体材料上生长增殖情况；将体外培养10d的软骨细胞／胶原海绵复合物植入裸鼠背部皮下，术后12周取材，进行大体观察和HE染色。结果：软骨细胞均匀分布于胶原海绵的孔壁和网眼内，并可分泌基质样物；复合培养物体内植入12周后可以形成新生透明软骨组织。结论：胶原海绵可以作为软骨细胞生长的支架载体，异位构建出组织工程化软骨组织。     

骨髓来源成骨细胞接种于珊瑚颗粒中异位成骨的观察

目的：为了寻找更好的构建组织工程骨的方法，探讨以天然多孔珊瑚作为支架材料，接种骨髓来源成骨细胞，植入体内后异位再造骨组织的可行性。方法：分离、培养、扩增兔骨髓基质干细胞，细胞长满后用基因重组人骨形成蛋白-2诱导3d；收集细胞，按5&;#215;10^7的浓度接种于珊瑚颗粒中，体外继续培养48h后，植入裸鼠背部皮下组织中，分别于植入术后1，2月取材，通过大体标本、X射线片、组织学检查观察新骨的形成情况。结果：植入术后l，2月，在裸鼠背部皮下组织中均形成了硬组织，1月标本表面粗糙，红白相间，2月标本表面较为光滑，为暗红色；2月标本X线摄片检查可见，在珊瑚颗粒间有明显的X射线阻射影；组织学检查可见，1月标本中，在珊瑚颗粒之间及珊瑚孔隙内，均有大量类骨质形成。并可见较多软骨组织，2月标本中新骨已较为成熟。结论：骨髓来源成骨细胞接种于珊瑚颗粒中，植入体内后可以在异位有效形成骨组织，为其用于组织工程骨提供了有利的实验依据。     

骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨

背景：研究证明骨髓基质干细胞与煅烧骨支架材料结合后可形成组织工程化骨,但在动物体内的生物相容性及皮下诱导成骨的能力国内报道较少. 目的：观察骨髓基质细胞复合异种煅烧骨植入BALB/c裸鼠背部皮下的成骨性能及煅烧骨材料作为组织工程骨支架材料的可行性. 方法：选用经脱脂及脱蛋白处理后高温煅烧形成的骨支架材料与梯度密度离心法分离培养至第3代的羊骨髓基质干细胞构建细胞-煅烧骨复合物植入 BALB/c 裸鼠背部皮下,选同期对侧背部皮下植入单纯煅烧骨为对照组. 结果与结论：煅烧后的松质骨块为白垩色,表面呈蜂窝状多孔结构,保留了天然松质骨的多孔状空间结构.骨小梁结构完整,孔隙相互连通.骨髓基质干细胞接种到煅烧骨后24 h可见大量细胞黏附于支架上,7 d后细胞分泌大量细胞外基质,细胞与基质分界不清,细胞能在材料上良好地黏附、增殖与生长,细胞活性未受到支架材料的影响.植入4周后,两组均可见煅烧骨边缘出现少量残片,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙周边可发现骨细胞,对照组煅烧骨表面可见纤维结缔组织包绕.植入后8周,两组均可见到煅烧骨部分降解为片状类骨质,周围有成纤维细胞包绕,排列紧密,形态多样,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙内可见煅烧骨表面有排列成行的成骨细胞,孔隙间有散在淋巴细胞浸润.对照组标本可见孔隙内有大量结缔组织长入,未见明显成骨迹象.结果说明,经高温煅烧后的松质骨材料,具有良好的生物相容性和生物安全性,可作为骨髓基质干细胞的良好载体,复合后植入体内能够诱导新生骨组织形成,可作为骨缺损组织工程修复的支架材料.     

自体骨髓基质干细胞及可注射藻酸钙凝胶联合Mosaicplasly技术修复山羊膝关节股骨头大面积缺损

背景:目前修复软骨缺损的方法都存在修复组织数量不足,生物力学性能不佳,整合不良及供区并发症等缺陷.对于大面积的骨软骨复合缺损单独应用一种方法尚显不足.目的:观察组织工程方法复合Mosaicplasty技术用于修复大面积骨软骨缺损的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2009-01/09在青岛大学医学院中心实验室完成.材料:体外培养并扩增健康成年雄性山羊的骨髓基质干细胞,收集约3×10~7细胞,加入1 mL藻酸钠溶液重悬形成骨髓基质干细胞一藻酸钙凝胶材料.方法:12只山羊用于制各膝关节股骨髁大面积骨软骨缺损模型,骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组使用自制Mosaicplasty器械,植入直径2 mm骨软骨柱镶嵌充填缺损,以自体骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶填充残余缺损和部分供区.Mosaicplasty组单纯用Mosaicplasty修复骨软骨缺损.对照组单纯制造缺损不修复.主要观察指标:①大体观察:术后4,8,16周分别切开关节观察修复效果.②组织学检查:术后16周取修复组织标本,行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色光镜下观察.③电镜观察:取16周修复组织行透射电镜检查.结果;术后16周时骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组移植物固定牢固,关节面平滑,移植物间界限消失,新生软骨组织类似于正常软骨,4-16周修复效果逐渐改善,优于其他各组.光镜观察细胞-凝胶新生软骨组织与移植软骨结合紧密,新生软骨细胞排列规整,细胞外基质分布均一.对照组无明显修复.透射电镜观察发现修复新生组织中细胞形态类似软骨细胞,细胞存在于排列紧密的纤维网格中,基质丰富.结论:使用自体骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶材料复合Mosaicplasty技术可促进骨软骨整合,改善其修复效果.     

聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架构建人组织工程软骨

目的:探讨聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法:实验于2004-09/2005-04在中国医科大学整形外科医院外耳整形与再造中心完成。①选取4周龄无胸腺雄性裸鼠8只,左侧背部皮下为软骨细胞-支架复合物组,右侧背部皮下为单纯支架对照组。人软骨细胞来源于中国医科大学整形外科医院外耳整形与再造中心临床小耳畸形患者行肋软骨移植时剩余的边脚料分离软骨细胞。聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物泡沫材料由清华大学化工系提供,1.0cm×1.0cm×0.3cm大小,环氧乙烷消毒后备用。②消化、分离、培养人肋软骨细胞,将第3代细胞制成悬液,细胞浓度为5×1010L-1。取1mL软骨细胞悬液与少量30%氧化异丙烯F-127溶液(4℃)均匀混合后接种至聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物支架上,形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后植入软骨细胞-支架复合物组,单纯支架对照组植入单纯聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架。③术后12周取材,行大体观察。利用苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、阿尔辛蓝-丽春红染色对再生的软骨组织进行组织学检测。结果:实验选取4周龄无胸腺雄性裸鼠8只,全部进入结果分析。①术后12周大体标本观察结果:软骨细胞-支架复合物组形成了与支架形态相同的乳白色类似软骨样组织,表面光滑有弹性。单纯支架对照组呈褐色,质地较软。②再生的软骨组织术后12周组织学检查结果:组织学检查证实软骨细胞-支架复合物组有软骨细胞存在,并且有基质分泌。单纯支架对照组无新生软骨组织形成。结论:利用聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架可在裸鼠体内形成人组织工程化软骨。     

可注射藻酸盐支架与人骨髓基质干细胞的体外复合培养

背景:目前可注射组织工程骨的研究主要限于动物实验,若人骨髓基质干细胞与藻酸盐生物相容性良好,可注射组织工程骨将是极具前途的临床治疗手段。目的:体外观察人骨髓基质干细胞与可注射支架藻酸钙凝胶的生物相容性。方法:实验组将第2代人骨髓基质干细胞与藻酸钙凝胶复合培养,对照组单纯接种骨髓基质干细胞。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况,MTT法半定量检测细胞增殖情况。结果与结论:倒置显微镜下见实验组细胞生长良好,与对照组无明显差异。扫描电镜见骨髓基质干细胞在藻酸钙表面贴附、增殖良好,第6天时细胞已跨越微孔表面或向孔内生长。MTT法显示与对照组相比,实验组细胞增殖能力不受影响。结果初步表明藻酸钙与人骨髓基质干细胞体外生物相容性较好。     

藻酸钙作为可注射骨髓载体的可行性研究

目的探讨藻酸钙水凝胶(CAH)作为自体骨髓(ABM)载体构建可注射骨替代物的可行性.方法在兔背部皮下随机注射藻酸钙自体骨髓复合物(CAH/ABM)、单纯ABM、CAH,术后2、4周取材,通过X线、组织学检查观察其异位诱导成骨能力,并对新生骨进行定量组织学研究和统计学比较.结果X线、组织学检查结果均表明CAH/ABM组有较多新骨形成,ABM组诱导出少量骨,CAH组未见新生骨,诱导骨量统计学上具有显著性差异(P<0.01).结论可注射CAH/ABM复合物具有良好的骨诱导性,CAH是ABM的良好载体之一.     

人转化生长因子β1基因转染骨髓基质干细胞复合藻酸钙修复骨软骨缺损

目的:拟利用人转化生长因子β 1基因转染骨髓基质干细胞,再与可降解藻酸钙材料复合构建具有较好生物学活性的组织工程化人工骨软骨,以期获得良好的软骨间整合.方法:雄性12个月龄的崇明山羊18只.由上海交通大学附属第九人民医院动物实验中心提供.携带人转化生长因子β 1基因的重组腺病毒由上海交通大学附属第九人民医院骨科研究室提供.制备藻酸钙凝胶的氯化钙、藻酸钠为Gibco公司产品.从羊髂嵴抽取8 mL骨髓,贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,传至第3代以携带人转化生长因子β 1基因的重组腺病毒转染过夜.18只山羊均于双膝股骨内髁负重区建立骨软骨缺损模型,造模后分为3组,6只,组:转染细胞-藻酸钙组将转染人转化生长因子β 1基因的骨髓基质干细胞悬于1.2%藻酸钠中,调整细胞密度为5×1010L-1,吸取5 mL注入骨软骨缺损处,随后缓慢滴入过量的2.5%氯化钙,使氯化钙与藻酸钠发生交联反应形成藻酸钙凝胶.复合对照组同法注入未转染人转化生长因子β 1基凼的骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶,模型组不给予任何干预.转染后Western blot法检测细胞外源基因的表达.移植后组织形态学检查及缺损评分.结果:人转化生长因子β 1基因转染后,骨髓基质干细胞表达人转化生长因子β 1,并分泌细胞外基质Ⅱ型胶原及Aggrecan.移植后24周,转染细胞-藻酸钙组缺损获得类透明样软骨修复,复合对照组及模型组均为纤维组织或纤维样软骨修复.与模型组比较,移植后第12,24周复合对照组、转染细胞.藻酸钙组骨软骨缺损组织形态学评分均明显升高(P<0.05),且转染细胞-藻酸钙组升高幅度显著大于复合对照组(P<0.05);转染细胞.藻酸钙组缺损评分随着修复时间的延长而明显升高(P<0.05).结论:实验成功将组织工程学与分子生物学有机结合,经基因修饰的骨髓基质干细胞可使人转化生长因子β1持续高效发挥作用,并逐步转化为成熟的软骨细胞且分泌软骨基质,与藻酸钙复合修复骨软骨缺损效果满意.     

部分去蛋白脱钙骨复合成骨细胞体内植入形成软骨或骨的可能性实验

背景：采用理化技术制备的天然生物骨衍生材料具有天然网状孔隙系统，具有良好的细胞相容性，有利于成骨细胞的附着及生长，可用于成骨细胞的支架材料。 目的：观察部分去蛋白脱钙骨作为成骨细胞支架材料体内植入的成骨作用。设计：随机对照实验。 单位：昆明医学院第一附属医院中心实验室。 材料：部分去蛋白脱钙骨；人胎骨膜成骨细胞；4周龄BALB／c裸小鼠20只，体质量25～28g，雌雄不限。 方法：实验于2003—01／06在昆明医学院第一附属医院中心实验室完成。将部分去蛋白脱钙骨与人胎骨膜成骨细胞体外复合培养1周后植入裸鼠体内，每只裸鼠共植4块材料，脊柱左侧植入材料与细胞的复合物，作为实验侧，右侧单纯植入材料，作为空白对照侧。于术后4周及8周取出材料行碱性磷酸酶活性及常规组织学检查。 主要观察指标：裸鼠植入材料取出后行一般观察、碱性磷酸酶活性及常规组织学检查。 结果：20只裸鼠均进入结果分析。①裸鼠植入材料一般观察：植入材料的周围组织未见坏死、化脓、积液等迹象，材料内有软组织长入，包裹。②碱性磷酸酶活性测定结果：部分去蛋白脱钙骨复合成骨细胞体内植入8周时碱性磷酸酶活性比4周时强[（22，854&;#177;6．018），（11．286&;#177;4．268）nkat／g]，并比单纯植入的材料强得多[（1．217&;#177;0．083），（2．717&;#177;0．583）nkat／g]。③常规组织学检查结果：实验侧4周见有软骨形成，8周时部分软骨形成骨组织，并见有髓腔，且软骨或新骨形成增多，而对照侧未见软骨或骨形成。 结论：部分去蛋白脱钙骨复合成骨细胞体内植入后能形成软骨或骨．并随植入时间的延长，软骨或新骨形成增多；部分去蛋白脱钙骨可用于成骨细胞的支架材料。     

无纺网与多孔海绵状材料作为软骨组织工程支架的适用性及体内降解性

背景：聚羟基乙酸无纺网与聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物多孔海绵具有良好的塑形适应性、生物降解性与生物相容性。 目的：观察聚羟基乙酸无纺网与聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物多孔海绵作为软骨组织工程支架的适用性及体内降解性。 方法：分别制备乳兔软骨细胞-聚羟基乙酸无纺网复合物、乳兔软骨细胞-聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物多孔海绵复合物。在实验组成年兔两侧背部皮下分别植入制备的两种复合物,在对照组成年兔两侧背部皮下分别植入聚羟基乙酸无纺网与聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物。 结果与结论：组织学观察显示,以聚羟基乙酸无纺网获取的组织工程软骨,植入4周时软骨细胞较小,软骨内有较多聚羟基乙酸纤维残留,8周时软骨细胞较成熟,包埋在陷窝内,聚羟基乙酸纤维消失,12周时软骨细胞成熟,基质分泌丰富,无聚羟基乙酸存留;以聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物多孔海绵获取的组织工程软骨,植入4周时软骨细胞不成熟,软骨基质内似“杂质”样材料残留物较多,8周时软骨细胞较成熟,软骨基质内仍可见材料残留,12周时软骨基质材料残留基本消失。两组组织工程软骨特殊染色与免疫组织化学检测均显示再生软骨胶原与基质黏多糖生成良好,软骨中均检测出Ⅱ型胶原。表明两种材料作为软骨组织工程支架具有良好的适用性,其降解时间均达到组织工程软骨构建的要求。     

聚乳酸/聚羟乙酸共聚物和Pluronic-F127凝胶为支架复合软骨细胞构建组织工程骨软骨复合组织的界面相容性

背景：目前关节软骨的损伤修复研究倾向于构建组织工程骨与软骨复合物,旨在修复软骨下骨缺损的同时,使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面,从而加快界面的愈合。目的：以三维多孔聚乳酸/聚羟乙酸共聚物（poly（lactide-co-glyco-lide）,PLGA）、Pluronic-F127水凝胶分别作为骨和软骨支架材料,验证两者作为组织工程支架联合应用于构建组织工程骨软骨组织的可行性。设计、时间及地点：开放性实验,2006-07/2007-04于中山大学附属第二医院医学研究中心完成细胞培养,于中山大学北校区实验动物中心完成动物实验。材料：将培养的新西兰大白兔关节软骨细胞和胫骨骨膜的成骨细胞分别与Pluronic-F127凝胶及PLGA混合形成复合物后,在骨细胞复合物的表面涂布负载软骨细胞的PluronicF-127水凝胶制备组织工程骨软骨复合物。方法：裸鼠20只切开背部皮肤及皮下组织,切口左侧植入组织工程骨软骨复合物1枚,切口右侧植入单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶各1枚为对照。主要观察指标：植入后2个月取材,进行大体形态学及组织学观察骨组织及软骨组织形成情况,II型胶原免疫组化观察软骨细胞Ⅱ型胶原表达能力。结果：术后2个月形成有弹性骨软骨复合物,在暗红色的部分,新形成的骨组织连接成片块状或条索状,PLGA已完全降解,在白色的部位,已形成较成熟的软骨组织,形态基本正常,分布较均匀,Pluronic-F127已完全吸收;软骨组织与骨组织的交界面处二者结合良好,部分区域可见软骨部分嵌入于骨组织中。实验组软骨组织II型胶原免疫组化染色呈阳性。结论：Pluronic-F127和PLGA作为骨和软骨支架材料,可以形成具有良好界面结合的骨软骨组织。     

AdLacZ基因修饰山羊耳软骨细胞复合F127构建组织工程化软骨

目的:应用AdLacZ基因修饰体外培养的山羊耳软骨细胞,并与Pluronic F127支架材料复合,观察裸鼠皮下软骨形成的情况,为进一步应用软骨分化因子基因修饰重建软骨的研究提供参数。方法:实验于2004-11/2006-12在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。①实验材料:取健康雄性山羊,体质量26～30kg。6周龄BALB/c裸鼠24只,体质量20g。体外培养山羊耳软骨细胞,转染AdLacZ基因,检测基因转染效率。②实验方法:将基因修饰的细胞与可吸收生物材料PluronicF127混合形成细胞-生物材料复合物,并注射到6只裸鼠皮下,每只在其背部皮下分别接种2个点,分别在术后2,4周取材,每个时间点有标本6例。另取裸鼠18只,同样设计,分别以未转基因的软骨细胞-材料复合物、单独注射的软骨细胞、或单独注射的F127支架作为对照组,每组6只。③实验评估:标本行苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色,并对4周标本行X-gal染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:纳入BALB/c裸鼠24只,均进入结果分析。①50pfu/细胞可以获得80%的转染效率。②2周时细胞-材料复合物形成了不成熟的软骨样组织,苏木精-伊红染色显示外周呈纤维样组织包裹,中部大部分为不成熟的软骨细胞;4周实验组中央部位出现少量稍成熟的软骨,阿利新蓝染色显示该部位为深蓝色的巢状软骨,部分细胞有Ⅱ型胶原阳性表达。冰冻切片X-gal染色提示细胞来自于植入的软骨-材料复合物。对照组未转基因的软骨细胞-材料复合物,其组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学表现与实验组没有明显差别,而X-gal染色为阴性。单独注射软骨细胞或单独注射F127支架,在4周内则均未见到软骨形成。结论:腺病毒载体可向软骨细胞高效转移目的基因,F127支架材料是软骨再生较为理想的支架材料。