河弧菌AL536_RS29525基因功能研究

  目的  探讨河弧菌基因组中VflT6SS2核心基因簇上游paar基因簇中AL536_RS29525的序列特征、对VflT6SS2分泌功能和杀菌活性的影响以及可能的调控机制。  方法  利用Muscle、GeneDoc软件进行AL536_RS29525基因编码产物的序列特征分析;同源重组技术构建AL536_RS29525的缺失株,PCR扩增AL536_RS29525编码序列克隆于pSRKTc获得回补质粒pSR-29525,继而导入?AL536_RS29525得到回补株;Western Blot （WB）检测相应菌株中VflT6SS2 Hcp蛋白的表达和分泌,以大肠埃希菌为prey的细菌竞争/杀菌实验检测VflT6SS2介导的菌株杀菌能力;基于Lux报告基因的启动子融合系统冷光检测确定AL536_RS29525缺失对VflT6SS2核心基因簇启动子和hcp启动子活性的影响;荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测hcp （tssD2）和vipA （tssB2） mRNA的相对表达水平。  结果  AL536_RS29525同源基因编码蛋白的结构和功能较为保守;缺失AL536_RS29525负性影响VflT6SS2 Hcp蛋白的表达及分泌,降低VflT6SS2介导的菌株杀菌能力,回补AL536_RS29525可恢复缺失株 Hcp 的表达、分泌和杀菌能力;缺失株?AL536_RS29525中hcp （tssD2）和vipA （tssB2）的mRNA表达量均低于野生株;而VflT6SS2的核心基因簇启动子和hcp启动子活性在?AL536_RS29525缺失株和野生株之间无显著差异。  结论  河弧菌AL536_RS29525基因较为保守,与霍乱弧菌以及弗尼斯弧菌的同源基因均具有较高的同源性。 AL536_RS29525基因是河弧菌VflT6SS2的重要组成部分,为其Hcp效应子的正常表达、分泌功能以及VflT6SS2介导的杀菌活性所必需。AL536_RS29525可能转录后水平影响VflT6SS2的功能表达。     

河弧菌paar基因功能研究

目的研究河弧菌85003 VI型分泌系统VflT6SS2核心基因簇上游paar基因（AL536_RS29530）编码蛋白的结构特征、功能及其对河弧菌VflT6SS2功能的影响。方法利用自杀质粒介导的同源重组技术构建paar基因缺失株,PCR扩增并克隆paar基因于pSRKTc表达载体获得回补质粒,导入相应缺失株得到回补株。 Western Blot（WB）检测缺失株和回补株中T6SS效应蛋白Hcp的表达和分泌,细菌杀菌实验检测菌株杀菌毒力变化。 荧光定量反转录聚合酶链式反应检测tssB2和hcp mRNA表达水平。 启动子-Lux报告系统的冷光表型检测确定VflT6SS2核心基因簇启动子及hcp启动子在野生株和缺失株背景下的活性差异。结果成功构建河弧菌85003的paar基因的精确缺失株和相应的回补株;WB检测缺失株中Hcp的表达和分泌较野生株明显降低,同时其对大肠埃希菌的菌间杀伤能力也降低,导入相应回补质粒可使缺失株Hcp的表达、分泌和杀菌表型恢复到野生株水平;hcp和tssB2的mRNA水平检测显示缺失株低于野生株,差异有显著性,但VflT6SS2核心基因簇的启动子活性和hcp启动子活性在野生株及缺失株中无明显差异,提示paar基因可能在转录后水平调控VflT6SS2。结论河弧菌中paar （AL536_RS29530）基因编码产物是河弧菌VflT6SS2的组成部分,为其功能所需,缺失该基因导致VflT6SS2的分泌和杀菌能力缺陷,但其具体的调控机制有待进一步研究。     

dndC基因在脉冲场凝胶电泳基因组降解中的作用及降解处理方法

  目的  了解大肠埃希菌和弗格森埃希菌dndC基因的携带情况,以及该基因与脉冲场凝胶电泳（PFGE）基因组降解表型之间的关系,探讨PFGE中菌株基因组降解的原因及处理方法。  方法  使用PFGE对450株大肠埃希菌和弗格森埃希菌进行分析,设计引物检测dndC基因的携带情况并进行序列测定。 通过dndC基因序列比对和进化树的构建,获得dndC基因型别以及其在不同型别大肠埃希菌中的分布。 通过添加硫脲和消毒电泳仪研究基因组降解的处理方法。  结果  450株大肠埃希菌和弗格森埃希菌中,降解的菌株为40株（8.89%）。 dndC基因阳性菌株33株（7.33%）,均出现了降解。 大肠埃希菌携带的dndC基因可分为8个群。 不同型别大肠埃希菌中均存在dndC基因阳性菌株,且阳性率存在差异。 添加硫脲可以有效缓解PFGE分析中dndC基因导致的降解,电泳仪消毒可以缓解全胶降解的情况。  结论  dndC基因会导致大肠埃希菌和弗格森埃希菌PFGE分析中基因组降解,添加硫脲可以缓解此降解。     

2018-2020年浙江省湖州市食源性疾病监测结果分析

  目的   了解浙江省湖州市食源性疾病的感染状况和流行病学特征。  方法   收集湖州市2018 — 2020年6家食源性疾病监测哨点医院（重点监测点和常规监测点各3家）上送的沙门菌、副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌、志贺菌分离菌株,再对分离菌株进行血清分型和毒力基因检测;采用real-time PCR方法进行诺如病毒核酸检测。  结果   共检测6783 例腹泻病例标本,检出病原体1373份,检出率为20.24%。 致泻性大肠埃希菌检出率为6.49%,主要以肠聚集性大肠埃希菌和产肠毒素大肠埃希菌为主;副溶血弧菌检出率5.31%,血清分型以 O3∶K6 为主,毒力基因以tdh 为主;沙门菌检出率为2.85%,以鼠伤寒沙门菌为主;诺如病毒阳性率为11.65%,基因型别以GⅡ.2［P16］为主。 致病菌引起的发病高峰在夏季,诺如病毒引起的发病高峰在冬春季, 20～39岁为主要感染人群。  结论   2018 — 2020年引起湖州市感染性腹泻的病原体为诺如病毒、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌和沙门菌,发病呈现明显的季节性和年龄分布。 应加强对食源性病原体的监测,有效控制食源性疾病的发生。     

一起产志贺毒素大肠埃希菌O146∶H10引起的食物中毒的溯源分析

  目的  对2019年广西壮族自治区桂林市发生的一起校内食物中毒进行病原检测及溯源分析。  方法  对该起食物中毒事件开展流行病学调查,采集腹泻患者粪便、餐厨工作人员肛拭子、留样食品、厨房环境及餐厨用具涂抹样本,按常规方法进行病原分离和鉴定,对分离的病原菌进行毒力基因检测及脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型分析。  结果  本次食物中毒事件共造成87人出现腹泻或其他症状。从1例腹泻患者粪便及1位餐厨工作人员肛拭子标本中分离到产志贺毒素大肠埃希菌,血清型均为O146∶H10,志贺毒素基因均为stx_1c亚型,且2株分离株具有相同的PFGE带型。  结论  这起食物中毒是由产志贺毒素大肠埃希菌O146∶H10引起,为国内首次报道由非O157产志贺毒素大肠埃希菌引起的食物中毒事件。     

北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断病例的感染致病菌检测分析

  目的  分析北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断病例的感染致病菌构成及病原特征,为该类疾病的科学防控提供依据。  方法  收集细菌性痢疾临床诊断病例44例,进行志贺菌属、弯曲菌属、沙门菌属、副溶血弧菌、霍乱弧菌、致泻大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌7种常见致病菌的分离培养,对分离菌株进行血清分型、分子分型及毒力基因检测。  结果  志贺菌属和小肠结肠炎耶尔森菌检出率为0,其他致病菌检出率由高到低依次为弯曲菌属（30.00%,9/30）、沙门菌属（18.18%,8/44）、副溶血弧菌（15.91%,7/44）、致泻大肠埃希菌（4.55%,12/44）、霍乱弧菌（3.13%,1/32）。 9株空肠弯曲菌分成9种ST型;8株沙门菌分成4种血清型,7种脉冲电场凝胶电泳带型;8株副溶血弧菌分成4种血清型,毒力基因特征均为tdh+/trh-;1株霍乱弧菌为非O1/O139血清型,毒力基因特征为ctx-/t3ss+。  结论  北京市顺义区细菌性痢疾临床诊断错误率较高。 细菌性痢疾临床诊断病例具有较高的致病菌检出率,以弯曲菌属、沙门菌属为优势构成。 志贺菌属与其他腹泻肠道致病菌的快速鉴别诊断应在临床尽快建立并推广应用。     

cAMP受体蛋白对嗜水气单胞菌生长初期胆汁耐受性的影响

  目的  本研究拟确定cAMP 受体蛋白 对嗜水气单胞菌胆汁耐受性的影响。  方法  构建嗜水气单胞菌的luxS、crp的缺失株及crp回补株，通过胆汁生长实验确定嗜水气单胞菌及其构建株的胆汁耐受性。  结果   嗜水气单胞菌BJ018、BJ018ΔluxS和BJ018Δcrp在LB培养基中生长速度基本一致。 10%胆汁LB中，BJ018和缺失株ΔluxS前8 h生长被抑制，后期呈对数快速生长；其缺失株Δcrp生长速度领先于野生株，早期生长未被抑制。 嗜水气单胞菌BJ018Δcrp的回补株早期生长重新被抑制，与野生株BJ018基本一致。 其他两株嗜水气单胞菌BJ017、BJ054及其缺失株Δcrp胆汁生长结果与BJ018、BJ018Δcrp一致。 这些结果提示嗜水气单胞菌CRP影响菌株对胆汁的耐受。   结论  CRP的存在影响嗜水气单胞菌在胆汁中的生长，可能在胆汁耐受调控中起到重要作用。     

鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的鉴定与免疫原性研究

  目的  构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白原核表达载体,诱导表达及纯化NFA47650蛋白,并分析其免疫原性。  方法  根据鼻疽诺卡菌nfa-47650基因序列设计并合成引物,通过PCR扩增基因片段并构建pET30a（+）表达载体,导入BL21大肠埃希菌诱导表达并纯化。 制备NFA47650小鼠抗血清,通过Western Blot对NFA47650蛋白进行亚细胞定位和免疫原性研究。  结果  成功构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的原核重组表达载体,该蛋白在BL21大肠埃希菌中以包涵体的形式高效表达。 Western Blot结果显示,NFA47650蛋白主要存在于菌体培养上清中,能够被鼻疽诺卡菌抗小鼠和兔血清特异性识别。 另外,该蛋白与巴西诺卡菌和盖尔森基兴诺卡菌抗小鼠血清均可发生血清交叉反应。  结论  鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白是一种分泌性蛋白,可以与不同种的诺卡菌抗血清发生免疫反应,引起免疫应答,是一种重要的免疫显性蛋白。     

联合分子检测法对腹泻患者粪便中致泻性大肠埃希菌的调查

  目的  采用胃肠道感染测试条（FA GI）联合实时聚合酶链式反应（PCR）直接检测法,回顾性调查山东省青岛市腹泻患者致泻性大肠埃希菌（DEC）的感染情况及菌株基因型,并与传统方法进行比较,探讨不同检测方法在腹泻监测中的应用。  方法  对2018年青岛市2家哨点医院采集的263份腹泻粪便标本,采用传统培养法分离大肠埃希菌并送至青岛市疾病预防控制中心,利用多重PCR方法鉴定DEC;同时采用FA GI联合实时PCR的方法直接检测粪便中的DEC。 将每5份粪便样标本混合为1份混合样品,用FA GI进行检测,再用实时PCR方法检测阳性混合样品中的单个样品。  结果  263份标本中,采用传统分离培养联合多重PCR法检测,15份样品阳性,阳性率为5.7%。 其中,肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）阳性的标本分别为7、4、3、1份。 采用FA GI联合实时PCR直接检测法检测,阳性样品35 份,阳性率为13.3%。 其中ETEC、EAEC、EPEC、EIEC阳性的标本分别为12、12、9、2份。 2种方法均未检到产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）阳性的标本。 2种方法毒力基因检测结果一致。 EAEC、ETEC、EPEC携带的主要毒力基因分别为pic、estIb和eae。  结论  FA GI联合实时PCR直接检测法显著提高了粪便中DEC的检出率,敏感性和特异性高,省时省力,可以辅助DEC常规监测,准确地反映DEC的流行和分布情况,为DEC的防控提供有力的实验室依据。     

产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌药敏试验结果分析

目的了解产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌分离株的耐药特点,为临床用药提供数据。方法收集我院临床分离的确证为产ESBLs的大肠埃希菌151株,应用聚合酶链反应(PCR)检测产ESBLs株质粒的CTX-M基因。采用NCCLS推荐的琼脂稀释法测定11种抗生素对所有产酶株的最低抑菌浓度(MIC),并对结果进行分析。结果PCR结果显示,151株产ESBLs大肠埃希菌中CTX-M阳性为139株。在139株产CTX-M大肠埃希菌中,亚胺培南的抗菌活性最强,敏感率为100%,MIC90为0·25μg/ml;其次为阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦,敏感率分别为92·1%和90·6%;头孢西丁对其也有一定的抗菌活性,敏感率为64·7%;环丙沙星和氨苄西林/舒巴坦抗菌活性非常低,敏感率分别为20·9%和0。结论本地区临床分离的大肠埃希菌所产的ESBLs大多为CTX-M型,亚胺培南、阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦对产CTX-M型ESBLs菌有很好的抗菌活性,氨苄西林/舒巴坦对其几乎没有抗菌作用。     

河弧菌可移动遗传元件的预测与分析

  目的  研究河弧菌中可移动遗传元件的种类和分布，探究其对河弧菌适应性进化的意义。  方法  从公共数据库中获取170株河弧菌的基因组数据，使用MGEfinder软件识别河弧菌中的可移动遗传元件，并对其种类、插入活性、分布及毒力因子进行研究。  结果  170株河弧菌基因组中共识别到1 227个可移动遗传元件。 这些元件可归类为完整噬菌体、不完整噬菌体、插入序列、含有第二类内含子的元件、含有丝氨酸/酪氨酸重组酶的元件、含有末端重复序列和编码基因的元件、只含有编码基因的元件以及不含任何开放读码框的元件共8类。 317个代表性元件序列簇中有307个转座活性都较低，但高转座活性的可移动遗传元件在河弧菌中分布更广泛。 可移动遗传元件携带的编码基因的功能主要涉及基因复制、重组、修复，以及基因转录等。 可移动遗传元件在环境分离株和临床分离株的分布没有差异。 在插入序列、含有丝氨酸/酪氨酸重组酶的元件、含有末端重复序列和编码基因的元件以及只含有编码基因的元件这4种可移动遗传元件中识别到多种毒力因子，且不同的可移动遗传元件携带的毒力因子不同。  结论  河弧菌含有多种类型、多种功能的可移动遗传元件，表现出以高转座活性可移动遗传元件为主导的适应性进化特征。     

肠球菌菌种鉴定方法的探索

  目的  选择一种能将肠球菌属鉴定到种水平的快速准确的方法。  方法  分别使用生化鉴定方法、16S rRNA基因测序技术、rpoA基因测序技术、基因组杂交技术（DNA–DNA hybridization,DDH）和平均核苷酸相似度（Average nucleotide identity,ANI）对12株肠球菌进行种水平鉴定,并比较生化鉴定方法、16S rRNA基因测序技术和rpoA基因测序技术和DDH/ANI结果的一致性。  结果  经过DDH和ANI鉴定,分离自高原野生岩羊粪便的12株肠球菌中有5株屎肠球菌,4株海氏肠球菌,1株蒙氏肠球菌,1株鹑鸡肠球菌和1株疑似肠球菌属内新种,rpoA基因序列比对结果与DDH/ANI结果高度一致,生化鉴定和16S rRNA基因测序技术与DDH/ANI结果不完全相符。  结论  rpoA基因序列比对可以方便快捷准确的将肠球菌鉴定到种水平。     

普通拟杆菌Bv46益生功能评估

  目的  评估普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）Bv46的生物特性和益生潜能。  方法  模拟胃肠道的酸性和胆盐环境，评估普通拟杆菌Bv46耐逆性特点；通过溶血、药敏和明胶酶定性实验评估其安全性；基于其自聚集、疏水性和对HT-29细胞的黏附情况评估其黏附能力；利用琼脂扩散、色谱和吸光度测定，评估Bv46对致病菌的拮抗、产酸和抗氧化功能。  结果  分离自健康人群的普通拟杆菌Bv46在模拟胃液和0.3%胆盐中的存活率分别为59.55%和63.76%；无溶血现象和明胶酶活性，除对氨苄西林和青霉素G耐药外，对其他所检测抗生素均敏感；Bv46具有中等自聚集能力、高疏水性和对HT-29细胞的中等黏附性；对致病性大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌的生长有抑制作用；此外，Bv46可以产生短链脂肪酸，并且具有抗氧化作用。  结论  普通拟杆菌Bv46是潜在的益生菌。     

引起我国首例婴儿肉毒中毒丁酸梭菌全基因组序列分析

  目的  对我国首次分离自婴儿肉毒中毒病例粪便样品的1株产E型肉毒毒素的丁酸梭菌进行全基因组测序，解析菌株产毒的遗传学特性。  方法  对从婴儿肉毒中毒病例粪便样品中分离的产E型肉毒毒素丁酸梭菌分离株TJ-S提取基因组DNA，利用Pacific Biosciences RSⅡ 平台对菌株进行全基因组测序，并进行序列分析。  结果  TJ-S基因组由一个染色体和一个质粒组成，大小分别为3 949 987 bp和747 151 bp。 GC含量分别为28.8%和28.2%。 染色体上携带产肉毒毒素的bont/e基因，该基因位于典型orfX基因簇内，且在基因簇上游存在3个转座酶编码基因。 遗传进化分析发现，菌株TJ-S在亲缘关系上与引起英国婴儿肉毒中毒的2株产E型肉毒毒素的丁酸梭菌分离株最为接近。  结论  丁酸梭菌携带的产E型肉毒毒素基因位于稳定的orfX基因簇内，可引起人类肉毒中毒。 本报道是我国第一次对产E型肉毒毒素丁酸梭菌进行全基因组学分析。     

一株mcr-1阳性韦太夫雷登沙门菌的鉴定和药物敏感性特征分析

  目的  鉴定1 株 mcr-1 阳性韦太夫雷登沙门菌并对其耐药特征及机制进行分析。  方法  基于肠道病原监测平台收集的分离于2015年的沙门菌株使用生化检测试验和血清凝集试验进行病原体鉴定和血清型分型,并用聚合酶链式反应方法检测mcr-1基因;使用微量肉汤稀释法进行药敏试验;使用质粒图谱和Southern-blot试验对菌株耐药基因mcr-1进行定位;用质粒接合转移试验验证mcr-1质粒的水平转移能力;提取细菌的质粒进行质粒测序,并对质粒序列进行注释分析及图谱的绘制。  结果  鉴定出1株mcr-1阳性的韦太夫雷登沙门菌,该菌株对多粘菌素耐药。 质粒图谱和Southern-blot结果显示mcr-1基因定位在约30 kb质粒上,质粒接合转移实验结果显示该质粒可以在肠道菌株之间水平转移。 质粒测序分析结果表明携带mcr-1基因的质粒pS68大小为32914 bp,类型为IncX4,该质粒同时携带有5个毒力基因。  结论  加强食源性病原菌监测和mcr-1耐药基因转移的分子流行病学研究,为更好的遏制耐药菌株的流行扩散提供坚实的基础。     

2018－2020年上海市B/Victoria系流感病毒的流行特征及基因特性分析

  目的  分析2018 — 2020年上海市分离的B/Victoria系流感毒株与疫苗株的匹配性及基因变异情况。  方法  利用血凝抑制实验,对142株B/Victoria系流感毒株进行了抗原性分析,并选取了63株开展了血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）基因序列分析。  结果  2018 — 2020年上海市流行的B/Victoria系流感毒株主要属于V1A.3分支,少数属于V1A.1分支及未缺失的V1A分支;抗原性分析显示,26.76%的流行株是疫苗株B/Colorado/06/2017鸡胚株的低反应株,与疫苗株相比,V1A.3分支流行株在HA蛋白的120环、150环、160环及190螺旋等关键的抗原决定簇及受体结合关键部位发生了5个氨基酸位点改变。  结论  2018 — 2020监测年度B/Victoria系流行株与世界卫生组织推荐的疫苗株组分B/Colorado/06/2017匹配性不佳,仍需密切监测流行株的谱系及变异情况,为疫苗株的筛选提供可靠的数据。