SNHG3调控miR-186-5p/ZEB1促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化的机制研究

［摘要］　目的　探究SNHG3调控miR-186-5p/E盒结合锌指蛋白1（ZEB1）促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）的机制。方法　在HepG2细胞中转染siRNA干扰片段敲除SNHG3、转染pcDNA3.1(+)/SNHG3使SNHG3过表达,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）检测是否转染成功。克隆形成实验检测HepG2细胞增殖,细胞划痕实验检测HepG2细胞迁移率,Transwell小室实验检测HepG2细胞侵袭数量,双荧光素酶活性检测验证SNHG3与miR-186-5p、miR-186-5p与ZEB1的靶向关系,FQ-PCR和Western blot法检测SNHG3、ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9、Snail的表达水平。结果　肝癌组织中SNHG3表达量高于正常组织,SNHG3表达量低/中的肝癌患者的生存预后优于SNHG3表达量高的肝癌患者,差异有统计学意义（P<0.05）。克隆形成实验结果显示,与pcDNA3.1(+)组相比,pcDNA3.1(+)/SNHG3组HepG2细胞增殖数量显著增加（P<0.05）。细胞划痕实验结果显示,pcDNA3.1(+)/SNHG3组HepG2细胞迁移率显著高于pcDNA3.1(+)组（P<0.05）。Transwell小室实验结果显示,pcDNA3.1(+)/SNHG3组HepG2细胞侵袭数量显著高于pcDNA3.1(+)组（P<0.05）。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-186-5p mimic和pGL6-SNHG3-WT共转染后,荧光素酶活性低于其他组,miR-186-5p mimic和pGL6-ZEB1-WT共转染后,荧光素酶活性低于其他组,差异有统计学意义（P<0.05）。FQ-PCR和Western blot检测结果显示,当SNHG3过表达时,E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量显著下调,N-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9和Snail mRNA和蛋白相对表达量以及ZEB1蛋白相对表达量显著上调;当SNHG3敲除后,E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量显著上调,N-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9和Snail mRNA和蛋白相对表达量以及ZEB1蛋白相对表达量显著下调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论　SNHG3调控miR-186-5p/ZEB1可促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,表明SNHG3是肝癌潜在的治疗靶点。     

下调miR-421靶向Sirt3调控HepG2肝癌细胞生长和侵袭的机制研究

目的探讨下调miR-421靶向Sirt3调控肝癌细胞生长和侵袭的机制。方法 RT-PCR方法测定肝癌细胞和正常肝细胞中miR-421表达变化。在肝癌细胞中转染miR-421 inhibitor,MTT测定细胞增殖变化,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力变化,Western blotting检测细胞中MMP-9和MMP-2蛋白表达变化。在线靶基因预测软件发现Sirt3可能是miR-421的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。在肝癌细胞中共转染miR-421 inhibitor、Sirt3 siRNA,利用上述方法测定细胞增殖、侵袭、迁移能力和MMP-9、MMP-2蛋白表达水平。结果 miR-421在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞。miR-421 inhibitor转染后的肝癌细胞增殖能力下降,细胞侵袭和迁移能力降低,细胞中MMP-9和MMP-2蛋白表达减少。Sirt3受到miR-421的靶向负调控作用。Sirt3 siRNA能够逆转miR-421 inhibitor对肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和MMP-9、MMP-2表达的抑制作用。结论下调miR-421靶向Sirt3抑制HepG2肝癌细胞生长和侵袭。     

miR-138-5p通过靶向SETD6基因调控Raf/MEK/ERK通路抑制肝癌细胞迁移、侵袭的分子机制

目的探究miR-138-5p通过靶向赖氨酸甲基转移酶(SETD6)基因调控Raf/MEK/细胞外信号调节激酶(ERK)通路抑制肝癌细胞迁移、侵袭的分子机制。方法qRT-PCR、Western印迹检测正常肝细胞L02、肝癌细胞HepG2、Hep3b、HuH-7细胞中miR-138-5p、SETD6的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力,Western印迹检测转染后Hep3b细胞中CyclinD1、基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白表达水平,双荧光素酶报告实验及Western印迹检测miR-138-5p与SETD6的联系。结果与人正常肝细胞L02比较,肝癌细胞HepG2、Hep3b、HuH-7中miR-138-5p的表达水平显著降低,SETD6水平显著升高(P<0.05),选择Hep3b细胞进行后续实验;与NC、miR-con组比较,miR-138-5p mimics组miR-138-5p的表达水平显著升高,细胞存活率、侵袭和迁移细胞数目、SETD6、CyclinD1、MMP-2水平显著降低(P<0.05);与NC、si-con组比较,si-SETD6组中SETD6蛋白水平显著降低,细胞存活率、侵袭和迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2水平显著减少(P<0.05);TargetScan生物信息学软件预测显示,miR-138-5p与SETD63'UTR存在结合位点,双荧光素酶报告实验显示,miR-138-5p与SETD63'UTR区域特异性结合,Western印迹进一步检测显示miR-138-5p与SETD6直接结合负向调控SETD6的表达;与miR-138-5p+pcDNA组比较,过表达SETD6后,miR-138-5p+pcDNA-SETD6组细胞存活率、侵袭和迁移细胞数目、SETD6、CyclinD1、MMP-2蛋白水平显著升高(P<0.05);与miR-con组比较,过表达miR-138-5p后,miR-138-5p组Raf、p-MEK、p-ERK蛋白水平显著降低,与miR-138-5p+pcDNA组比较,过表达SETD6后,miR-138-5p+pcDNA-SETD6组Raf、p-MEK、p-ERK蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移受到miR-138-5p及SETD6的双重调控,miR-138-5p可能通过调节SETD6的表达调控Raf/MEK/ERK通路进而调节肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,可为肝癌患者分子靶向治疗研究提供思路。     

miR-1226靶向MUC1对非小细胞肺癌细胞吉非替尼敏感性的影响

目的研究miR-1226对非小细胞肺癌(NSCLC)吉非替尼敏感性的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养NSCLC细胞株人肺癌耐吉非替尼细胞株(PC9GR)和人肺腺癌细胞(PC-9);将PC-9组细胞设置为正常组,PC9GR细胞随机分为对照组、miR-1226 mimic组和miR-1226 NC组,并进行转染;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测转染后各组细胞miR-1226及黏蛋白1(MUC1)mRNA表达情况;采用蛋白印迹分析法检测转染后各组细胞MUC1蛋白表达情况;采用MTT法检测转染后各组细胞对吉非替尼的敏感性;Transwell法检测转染后各组细胞的侵袭能力;采用双荧光素酶报告实验验证miR-1226与MUC1的靶向关系。结果与正常组相比,对照组和miR-1226 NC组PC9GR细胞miR-1226表达水平显著降低(P<0.05),IC50值、MUC1 mRNA及MUC1蛋白相对表达量、细胞侵袭数量显著升高(P<0.05);与对照组和miR-1226 NC组相比,miR-1226 mimic组PC9GR细胞miR-1226表达水平显著升高(P<0.05),IC50值、MUC1 mRNA及MUC1蛋白相对表达量、细胞侵袭数量显著降低(P<0.05);与MUC1-3′UTR-WT+miR-1226 NC组比,MUC1-3′UTR-WT+miR-1226 mimic组荧光素酶活性降低(P<0.05)。结论miR-1226过表达可能通过靶向下调MUC1表达,提高人非小细胞肺癌细胞吉非替尼敏感性。     

miR-526b-3p调控TROAP基因介导Wnt信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭迁移的影响

目的 探究miR-526b-3p调控滋养素相关蛋白(TROAP)基因介导Wnt信号通路对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖与侵袭迁移的影响。方法 测定人肺泡上皮细胞及NSCLC细胞系A549、HCC827、NCI-H1299中miR-526b-3p及TROAP、Wnt基因的表达水平。将体外培养的A549细胞随机分为对照组、miR-526b-3p mimic组、miR-526b-3p mimic阴性对照组、miR-526b-3p mimic+TROAP过表达组、miR-526b-3p mimic+Wnt过表达组，分组转染后，测定各组细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、细胞增殖相关基因(Cyclin D1)、凋亡相关基因(Bax、Caspase-3)、上皮间质转化相关基因(E-cadherin、Vimentin)、TROAP基因、Wnt基因及miR-526b-3p表达、细胞Cyclin D1、Bax、Caspase-3、E-cadherin、Vimentin、TROAP及Wnt蛋白表达、miR-526b-3p对TROAP的靶向调控作用。结果 与对照组相比，miR-526b-3p mimic组细胞呈...     

miR-5188在肝癌细胞中的作用及网络调控机制研究

目的 探究miR-5188在肝癌细胞中的作用及网络调控机制。方法过表达或敲低miR-5188表达后,检测肝癌细胞HepG2的增殖能力。利用miRNA靶基因预测数据库miRDB获取miR-5188潜在的靶基因,使用小干扰RNA(siRNA)敲低HepG2细胞中的上述靶基因后检测细胞增殖能力。采用实时荧光定量PCR法检测正常肝细胞LO2和HepG2细胞中mi R-5188、pre-miR-5188和pri-miR-5188的表达水平,并分析长链非编码RNA NEAT1（下文简称NEAT1）、NONO/PSF复合体对pri-miR-5188的影响。结果过表达mi R-5188后,HepG2细胞的增殖能力增强;敲低miR-5188表达后,HepG2细胞的增殖能力减弱,差异均有统计学意义（P均<0.05）。敲低DIDO1表达后,HepG2细胞的增殖能力增强;过表达DIDO1后,HepG2细胞的增殖能力减弱,差异均有统计学意义（P均<0.05）。过表达miR-5188后,HepG2细胞中DIDO1的表达水平降低;敲低miR-5188表达后,HepG2细胞中DIDO1的表达水平升高,差异...     

miR-141-3p靶向CBX1抑制乳腺癌细胞增殖和细胞迁移侵袭

目的探讨miR-141-3p对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及潜在的作用机制。方法实验设置miR-con组、miR-141-3p组、si-con组、si-染色体同源物(CBX)1组、anti-miR-con组、anti-miR-141-3p组、miR-141-3p+pcDNA组、miR-141-3p+pcDNA-CBX1组;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-141-3p和CBX1 mRNA的表达水平;Western印迹检测蛋白表达;MTT法检测细胞活性;Transwell检测各组细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果与正常乳腺细胞HBL-100相比,乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和BT474中miR-141-3p的表达水平显著降低,CBX1的表达水平显著升高(P0.05);过表达miR-141-3p、沉默CBX1均可抑制SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭,抑制CBX1、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白的表达(P0.05)。miR-141-3p靶向调控CBX1的表达,过表达CBX1能逆转miR-141-3p对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论 miR-141-3p可能通过下调CBX1表达抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

miR-370靶向FoxO1抑制TNF-α诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的 研究miR-370对肿瘤坏死因子(TNF)-α 诱导的肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制.方法 运用溴化噻唑蓝四唑(MTT)法、Transwell法检测TNF-α处理的肝癌细胞HepG-2的增殖、迁移和侵袭;用脂质体法将pcDNA(TNF-α+pcDNA组)、pcDNA-叉头框基因(Fox)O1(TNF-α+pcDNA-FoxO1组)、anti-miR-con(TNF-α+anti-miR-con组)、anti-miR-370(TNF-α+anti-miR-370组)、anti-miR-370和si-con(TNF-α+anti-miR-370+si-con组)、anti-miR-370和si-FoxO1(TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1组)转染至HepG-2细胞,再用TNF-α处理48 h;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性.结果 与对照组相比,TNF-α 处理的肝癌细胞HepG-2中细胞增殖、迁移和侵袭均显著升高,FoxO1表达显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001);过表达FoxO1、抑制miR-370均可抑制TNF-α 对HepG-2细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用;miR-370可抑制野生型FoxO1细胞的荧光活性,并负向调控FoxO1的蛋白;敲减FoxO1可逆转抑制miR-370对TNF-α诱导的肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用.结论 抑制miR-370可靶向FoxO1抑制TNF-α 诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,miR-370可能是肝癌的潜在分子靶点.     

Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用

目的：探讨Notch1基因在调控人肝癌细胞HepG2侵袭转移中的作用。方法将Notch1细胞内段（ pc-NICD）、干扰RNA和pEGF-C1空载体转入到HepG2细胞中,筛选稳定表达的细胞,采用荧光显微镜、RT-PCR及Western blot检测Notch1 mRNA及蛋白;采用Transwell迁移及Matrigel侵袭实验鉴定HepG2细胞侵袭、迁移能力。结果上调Notch1受体表达,可使肝癌细胞HepG2迁移侵袭能力增强;反之,下调Notch1受体表达时,细胞迁移侵袭能力减弱（P均＜0．05）。结论 Notch1基因对肝癌细胞HepG2的侵袭、转移具有重要作用。     

miR-302a靶向E2F1抑制胃癌BGC-823细胞EMT并降低细胞侵袭和迁移能力的实验研究

目的探讨miR-302a对胃癌BGC-823细胞上皮间质转化(EMT)、侵袭和迁移能力的影响和机制。方法在胃癌BGC-823细胞中转染miR-302a mimics,CCK-8测定细胞增殖变化,Transwell小室测定迁移和侵袭,Western blotting检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达。靶基因预测软件预测E2F1可能为miR-302a的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。在胃癌BGC-823细胞中共转染pcDNA 3.1-E2F1和miR-302a mimics,按照上述方法测定细胞增殖、侵袭、迁移和E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、E2F1蛋白表达水平。结果miR-302a mimics降低胃癌BGC-823细胞增殖、侵袭和迁移能力,下调细胞中Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平,促进细胞中E-cadherin蛋白表达。miR-302a靶向负调控E2F1表达。pcDNA 3.1-E2F1能够提高miR-302a mimics条件下胃癌BGC-823细胞中E2F1蛋白表达水平,促进细胞增殖、侵袭和迁移,促进细胞中Vimentin、N-cadherin蛋白表达,减少细胞中E-cadherin蛋白表达。结论miR-302a靶向E2F1抑制胃癌BGC-823细胞EMT并降低细胞侵袭和迁移能力。     

甲型H1N1流感合并肺炎的临床特点分析

目的通过对甲型H1N1流感合并肺炎的临床特点的分析。方法分析2009年月10月-2010年3月在我院入住的29例甲型H1N1流感合并肺炎患者的临床表现、实验室检查及胸部CT等资料。结果本组病例男性16例,女性13例。3例妊娠,13例合并有基础疾病。所有病例均有流感样前驱症状,呼吸道主要症状为发热、干咳少痰,严重者气短、呼吸困难、咯血。合并细菌感染时咯脓痰。肺部听诊无啰音或少啰音,合并哮喘时有哮鸣音,合并细菌感染时可有湿啰音。实验室检查65%白细胞不高或降低,41%心肌酶升高,58.6%存在低氧血症,35%呼吸衰竭。影像学表现多种多样：65.5%主要为单侧或双侧棉团样、团片样边界模糊高密度渗出影伴肺实变,其内见充气支气管征,病变沿支气管血管束分布。轻症及早期较局限,重症者及晚期病变融合呈双肺多发弥漫性改变。少数呈大叶及小叶性肺炎表现。预后大多良好,病死率6.9%。主要死亡原因为呼吸衰竭及大咯血。结论甲型H1N1流感合并肺炎是以甲型H1N1流感病毒肺炎为主要疾病的多种肺炎构成。甲型H1N1流感病毒肺炎临床表现具有流感病毒肺炎共性特点,其影像学表现有一定特征性。     

代谢酶基因CYP 1A1与广西胃癌遗传易感性的关系

目的探讨代谢酶基因CYP 1A1MSP1多态性与广西地区汉族、壮族人群胃癌遗传易感性之间相关性。方法采用PCR-RFLP技术检测广西地区汉族、壮族人群中121例胃癌患者和138例健康人CYP1A1MSP1多态性的分布频率,分析其与广西地区汉族、壮族人群胃癌遗传易感性的相关性及与吸烟、饮酒在胃癌易感性中的相互作用。结果 (1)CYP 1A1MSP1三种基因型(m1/m1、m1/m2、m2/m2)分布频率在两组间比较差异无统计学意义(χ2=0.901,P=0.342);(2)携带CYP1A1MSP1突变m2基因型的个体较携带m1/m1基因型的个体患胃癌的风险增加(OR=1.509),但差异无统计学意义(P=0.342)。结论单独的CYP 1A1基因MSP1多态性与广西地区汉族、壮族人群胃癌易感性无明显相关性。     

Trp-21 is important in the processing and secretion of big endothelin-1

To investigate the intracellular processing of endothelin-1 (ET-1), the synthesis and secretion of preproET-1 (PPET-1) was studied in transiently transfected COS-7 cells. Replacements at the highly conserved C-terminal region of ET-1 were made by site-directed mutagenesis, with codons for residues Ile-20 and Trp-21 being replaced by one for Ala in the PPET-1 cDNA. The mutant and wildtype PPET-1 cDNAs were expressed in COS-7 cells following transient transfection, and cell media and extracts, collected after 48 h, were assayed for ET-1 and big ET-1 by radioimmunoassay. The concentration of immunoreactive ET-1 in the medium obtained from the Ala-21-ET-1 mutant was 10-fold lower than that from PPET-1 wildtype and (Ala-20-ET-1) PPET-1 transfected cells. Moreover, Ala-21 -big ET-1 accumulated in the cells transfected with the cDNA for (Ala-21-ET-1) PPET-1, whereas there was no significant accumulation of ET-1-like or big ET-1-like immunoreactivity in the cells transfected with cDNAs for PPET-1 wildtype and (Ala-20-ET-1) PPET-1. These results suggest that Trp-21 is involved in intracellular processing and secretion of big ET-1.     

One SUMO is sufficient to silence the dimeric potassium channel K2P1

Small ubiquitin modifier 1 (SUMO1) is shown to regulate K2P1 background channels in the plasma membrane (PM) of live mammalian cells. Confocal microscopy reveals native SUMO1, SAE1, and Ubc9 (the enzymes that activate and conjugate SUMO1) at PM where SUMO1 and expressed human K2P1 are demonstrated to colocalize. Silent K2P1 channels in excised PM patches are activated by SUMO isopeptidase (SENP1) and resilenced by SUMO1. K2P1-Lys274 is crucial: when mutated to Gln, Arg, Glu, Asp, Cys, or Ala, the channels are constitutively active and insensitive to SUMO1 and SENP1. Tandem mass spectrometry confirms conjugation of SUMO1 to the ε-amino group of Lys274 in vitro. FRET microscopy shows that assembly of K2P1 and SUMO1 requires Lys274. Single-particle TIRF microscopy shows that wild-type channels in PM have two K2P1 subunits and assemble with two SUMO1 monomers. Although channels engineered with one Lys274 site carry just one SUMO1 they are activated and silenced by SENP1 and SUMO1 like wild-type channels.     

SF-1和DAX-1在发育内分泌学的研究进展

核受体的作用极其广泛 ,类固醇生成因子 1(SF 1)和剂量敏感的性别转换综合征和先天性肾上腺发育不良症的关键基因 1(DAX 1)两种核受体家族是近年来发育内分泌学研究的热点之一 ,通过SF 1和DAX 1的动物模型及人类基因突变表现型阐述了在胚胎早期性发育和性分化中SF 1和DAX 1的作用可能通过相同途径相互拮抗 ,在垂体促性腺细胞和肾上腺能细胞中 ,两者在细胞及组织中的分布一致 ,通过下丘脑对垂体 性腺轴及垂体 肾上腺轴发育过程中不同时期的各个环节进行调控 ,本文对SF 1和DAX 1在内分泌器官发育过程中的分布、结构及其作用进行综述。     

大鼠胰岛B细胞长寿基因SIRT1与转录调节因子FOXO1表达及其相关性研究

目的探讨大鼠胰岛B细胞在衰老进程中长寿基因SIRT1与转录调节因子FOXO1表达的相关性。方法2005年10月至2006年10月,在汕头大学医学院第二附属医院将11只18月龄健康雄性SD大鼠随机分为热量限制(CR)组6只和正常喂养对照组5只,饲养6个月后取胰尾组织,应用免疫组化染色分别检测胰岛中SIRT1、FOXO1和胰岛素表达及分布,衰老相关β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色以反映胰岛B细胞衰老情况。结果SIRT1与FOXO1均可表达于胰岛细胞胞浆、胞核中;β-Gal和胰岛素表达于细胞浆中;与对照组大鼠相比,CR组大鼠胰岛SIRT1表达量较多(P<0.05),衰老相关β-Gal染色强度较弱(P<0.01),胰岛素表达量较低(P<0.05),但FOXO1表达量差异无显著性意义(P>0.05),伴随着SIRT1表达增加,FOXO1胞核阳性率明显降低(P<0.01)。结论热量限制诱导了大鼠胰岛B细胞SIRT1蛋白高表达;SIRT1可能通过抑制FOXO1活性而调控胰岛B细胞的衰老,有利于2型糖尿病的防治。     

PD-1/PD-L1途径在慢性病毒感染中的作用

程序性死亡因子配体-1(PD-L1)分子是B7超家族的重要成员,在单核细胞、树突状细胞及大部分外周组织可以广泛诱导性表达。PD-L1可以和程序性死亡-1(PD-1)及CD80受体结合调节淋巴细胞的功能。PD-1/PD-L1信号在病毒感染后效应T细胞免疫耐受中具有重要作用,并且预示阻断该途径可能是抗病毒感染治疗的方向之一。