低氧启动腺相关病毒载体的构建及高感染滴度质粒辅助重组腺相关病毒的获取

目的构建低氧启动重组腺相关病毒载体 ,优化重组AAV的条件 ,获取高感染滴度低氧启动重组腺相关病毒 ,为基因治疗缺血性脑血管病提供高效的特异性表达目的基因的载体。方法AAVHelperfree系统购自stratagene ,HEK293细胞购自中国协和医科大学细胞中心 ,XL -10 -GoldE.coli购自stratagene ,胎牛血清 ,细胞培养基DMEM、IMDM、MEM、Hepes均购自Gibco,PIRES -EGFP购自Clontech ,pGL3、荧光素酶检测系统、T4DNA连接酶购自Promega;BamHI等内切酶购自Takala。采用PCR和同尾酶的方法合成5拷贝HRE -CMV -mp,酶切连接构建荧光素酶低氧启动腺相关病毒载体 ;扩增提取病毒载体质粒、辅助质粒和Cap、Rep蛋白质粒 ;大量培养HEK293细胞 ;质粒磷酸钙共转染 ;转染48h收获病毒(氯彷 -PEG8000) ;测定生物滴度、物理滴度、电镜观察病毒和病毒蛋白电泳。测定低氧2 %和正常氧压下荧光素酶的效价。结果获取感染滴度2×1011的低氧启动腺相关病素 ,低氧6h荧光素酶表达量是正常氧压时的59倍。结论重组AAV病毒载体是通过对AAV病毒进行改造 ,将自身的编码基因去除 ,使其能装载治疗基因及表达元件而产生的。rAAV载体具有转染效率高、重复性强 ,不激活免疫反应 ,可重复应用 ,不诱导基因突变的优势。但腺相关病毒载体长期稳定表达目的基因     

NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体.方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒, 再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内, 与辅助质粒pAAV/Ad、 腺病毒质粒pFG140共同转染HEK-293细胞, 通过同源重组获得NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体, 收集病毒上清, Dot blot法测定其滴度.MTT比色法观察NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体, 对HepG2细胞存活率的影响.结果:经酶切及测序证实克隆出NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因; 得到高滴度的(3.14×1015 pfu/L)重组腺相关病毒表达载体.NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体, 对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用, 与对照组比较, 处理组细胞的存活率明显降低.结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体, 为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础.     

Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒载体的构建及其表达

目的 :构建Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒 (AAV)载体 ,并转染到人肾小管上皮细胞中表达。方法 :利用基因重组技术 ,采用BamHI和XhoI双酶分别将pcDNA3中的目的基因Smad6 /flag和Smad 7/flag融合基因片断切出 ,再克隆到质粒pAAV MCS中 ,构建重组质粒pAA Smad 6 /flag和pAA Smad 7/flag。采用磷酸钙沉淀法 ,以重组质粒或pAAV LacZ以及pAAV RC、pHelper共转染HEK2 93细胞 ,产生均有传染性的病毒颗粒。再将此病毒颗粒转染到培养的人肾小管细胞中 ,用免疫组化法检测其Smad 6和Smad 7转移基因的表达。结果 :成功地构建Smad 6和Smad 7基因的腺相关病毒载体 ,并可在肾小管上皮细胞中表达Smad 6和Smad 7。结论 :肾小管细胞能稳定、高效表达外源Smad 6和Smad 7,为今后建立Smad 6和Smad 7AAV基因治疗体内肾纤维化的模型奠定了良好的基础     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

小鼠次级淋巴组织趋化因子成熟肽基因/腺相关病毒重组载体的构建

目的 构建含小鼠次级淋巴组织趋化因子(SLC)cDNA的重组腺相关病毒载体。方法 以C57BL/6J小鼠的淋巴组织为材料抽提总RNA，用RT-PCR方法克隆小鼠SLC的成熟肽基因。PCR产物回收后经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，插入pAAV-IRES-hrGFP质粒，用磷酸钙法，与pAAV-RC和pHelper三者共同转染HEK293细胞，包装成重组的病毒颗粒，并通过绿色荧光蛋白(GFP)报告基因荧光检测及抽提病毒DNA，进行PCR扩增等进一步证实重组病毒的形成。结果 约500bp的小鼠SLC成熟肽基因被成功克隆，序列分析表明，所克隆的SLC基因与基因库注册的相同，重组载体的酶切及测序鉴定表明SLC基因被定向插入。重组载体转染HEK293细胞，经荧光显微镜和病毒。DNA的PCR检测，证实已完成对重组病毒的包装，并表达GFP。结论 成功构建了SLC成熟肽基因重组腺相关病毒载体。     

可溶性CD20在HEK293T细胞中的高效表达

目的构建CD20真核表达载体,在HEK293T细胞中高效表达CD20蛋白。方法以人外周血单个核细胞(PBMC总RNA为模板,反转录PCR扩增得到CD20基因,并插入真核表达载体p CMV3-C-His,PCR初步验证后,再测序验证。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞进行蛋白表达,ELISA、Western blot法检测CD20蛋白表达,优化表达条件。结果 PCR与测序均显示成功插入CD20基因。转染HEK293T细胞72 h后,Western blot法检测到细胞内和细胞培养上清液中的CD20蛋白。HEK293T细胞传代次数与细胞培养上清液中CD20表达量相关。结论成功构建CD20真核表达载体,高效表达CD20可溶性蛋白。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。 目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。 方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。 结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达及生物活性分析

目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,收集转染上清,以Western blot法检测目的蛋白的表达,应用L929细胞测定重组表达产物对人和大鼠TNF-α细胞毒中和活性,采用ELISA比较重组表达产物对人和大鼠TNF-α的结合活性。结果成功构建重组表达载体pAAV/hTNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白hTNFR-Fc的表达,重组表达产物可有效结合人TNF-α并中和其L929细胞毒活性,并对大鼠TNF-α具有一定程度的结合和中和活性。结论成功构建了hTNFR-Fc融合基因,验证了其在AAV载体上的分泌性表达,并对其生物活性进行了鉴定,为进一步病毒包装和大鼠关节炎动物实验研究奠定了基础。     

Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因。通过HpaⅠ/XhoⅠ双酶切及其后的连接将其插入Lentilox3.7（pLL-3.7）质粒中。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Hsa-mir-196b的表达变化。结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒。所得慢病毒上清滴度为（7.2±1.1）×107TU/ml。感染慢病毒的239FT细胞中,Hsa-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍。结论成功构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体。     

丙型肝炎病毒非结构基因5b(NS 5b)区一级结构的变异

目的　分析中国丙型肝炎病毒非结构基因５ ｂ 区核苷酸序列变异。方法　以逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ） 从４９ 例中国病人的血清中获得互补的ＤＮＡ片段,产物克隆后测序。结果　３３ 株系基因Ⅱ１ ｂ 型,１６ 株系Ⅲ２ ａ 型,中国ＨＣＶ株型与日本ＨＣＶ株型同属１ 个基因亚型,但在一些核苷酸保守位点上有一定的差异,对３３ 株Ⅱ１ ｂ 型和１６ 株Ⅲ２ ａ 型间的同源性进行比较,发现１６ 株Ⅲ２ ａ 型的同源性低于３３ 株Ⅱ１ ｂ 型的同源性。首次在ＨＣＶＮＳ５ ｂ 区发现１ 个新的３ 个核苷酸的缺失突变及１ 个移码突变。结论　同一基因亚型之内不同ＨＣＶ株的核苷酸序列可能具有一定的地理分布特征,每个地区有一定的流行株。     

丙型肝炎病毒非结构基因5b的变异及与干扰素治疗的关系

以聚合酶链反应直接序列分析方法测定了４例无症状慢性丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者，与９例接受干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者血清中ＨＣＶ非结构基因５ｂ（ＮＳ５ｂ）ｃＤＮＡ的序列。发现，与已发表的Ⅱ／１ｂ型ＨＣＶ序列相比，无症状慢性ＨＣＶ感染者的ＨＣＶ在核苷酸水平的同源性高于干扰素治疗有效的慢性丙型肝炎患者（９５．６５％±２．６１％比９４．３５％±２．２９％），后者又高于干扰素治疗无效的慢性丙型肝炎患者（９２．７０％±１．９０％）。还发现在干扰素治疗后，治疗无效者血清中ＨＣＶＮＳ５ｂｃＤＮＡ序列发生明显变化，在所测定的３８０个核苷酸中有９～４８个发生碱基替换，从而导致所编码的氨基酸中有６～２０个发生突变。结果提示，ＨＣＶＮＳ５ｂ基因变异与病情及干扰素治疗有一定关系。变异较大者常出现明显的临床表现，且干扰素治疗可能趋势于失败。     

Humoral immunity to immunodominant epitopes of Hepatitis C virus in individuals infected with genotypes 1a or 1b

Cellular immunity against multiple Hepatitis C virus (HCV) proteins is observed in patients acutely infected with HCV most of whom later resolve infection. We wished to assess humoral immunity in patients infected with HCV 1a or 1b genotypes in relation to viral load using plasma samples from HCV-infected individuals and a panel of peptides representing immunodominant epitopes of HCV structural and nonstructural proteins. Plasma from HCV 1a- and 1b-infected patients, respectively, were divided into two groups: patients with low viral load (<==100,000 RNA copies/ml) and patients with high viral load (>/=10,000,000 RNA copies/ml). The antigens were peptides representing epitopes from immunodominant regions of HCV core, E2, NS3, and NS4 proteins, as well as the hypervariable (HVR) epitopes in E2 from genotypes 1a and 1b. Individuals infected with HCV 1a evoked a stronger immune response to many immunodominant epitopes of HCV relative to individuals infected with HCV 1b. Moreover, among individuals infected with HCV 1a, those with low viral loads mounted significantly greater responses against these epitopes than did individuals with high viral loads. Our observations demonstrate that quantitatively different antibody responses are elicited against HCV depending on the genotype of infecting virus, and suggest that humoral immunity directed against multiple immunodominant epitopes in HCV 1a-infected individuals may help lower viral load in vivo.     

乙肝病毒核酸疫苗诱导H-2b小鼠特异性免疫反应的初步研究

目的：观察并证实adr和adw亚型NHBs核酸疫苗单独应用，或与HBc核酸疫苗联合免疫诱导H－2^b小鼠的特异性体液和细胞免疫反应，方法：C57BL／6（H－2^b)小鼠随机分为4组：pJW4303组（P组，5只），pJW4303/MHBs/adw组（W组，6只）；pJW4303/MHBs/adr组（R组，6只）;pJW4303/MHBs/adr pJW4303/HBc组（R＋C组，6只），免疫方法为各组小鼠每只每次注射相应的质粒DNA疫苗100μg(100μl)，免疫程序为0，2，4w，小鼠血清抗HBs和抗HBc水平以及小鼠脾淋巴细胞培养上清中的IFN－γ和IL－4浓度用ELISA法检测，小鼠淋巴细胞抗原特异性增殖试验采用3H－TdR掺入法，计算刺激指数（SI），结果：W，R，R＋C各免疫组在末次免疫后4w所有小鼠均产生抗－HBs，但各免疫组间无明显差异，抗－HBs以R＋C组最早出现，R＋C组小鼠在第1次免疫后2w抗－HBc即全部阳性，P组免疫后始终末出现抗－HBs和抗－HBc，核酸疫苗免疫的W，R，R＋C各组免疫小鼠HBsAg特异性脾淋巴细胞增殖指数（SI）均高于P组（P＜0．01－P＜0．001），R＋C（n=6)组小鼠脾淋巴细胞HBsAg特异性SI比R组显著升高（P＜0．05），R＋C免疫小鼠HBcAg特异性脾淋巴细胞增殖指数（SI）均≥2，与P组（其SI均＜2）相比差异非常显著（P＜0．001），W，R，R＋C各免疫组小鼠脾淋巴细胞与HBsAg共培养的上清中IFN－γ的浓度比P组显著升高（P＜0．001），而它们的IL－4 浓度比P组明显下降（P＜0．001），R＋C免疫组小鼠脾淋巴细胞与HBcAg共培养的上清中IFN－γ浓度也较P组明显升高（P＜0．05），但其IL－4浓度与P组无差别（P＞0．05），结论：adr亚型和adw亚型HBV外膜中蛋白（MHBs)核酸疫苗和HBcAg核酸疫苗能诱导H－2b小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答，具有良好的体液和细胞免疫原性，MHBs核酸疫苗与HBcAg核酸疫苗联合免疫能加强MHBs核酸疫苗诱导的体液和细胞免疫反应，所诱导出的辅助性T细胞免疫反应为Th1型。     

Production of infectious hepatitis C virus particles in three-dimensional cultures of the cell line carrying the genome-length dicistronic viral RNA of genotype 1b

We show that a dicistronic hepatitis C virus (HCV) genome of genotype 1b supports the production and secretion of infectious HCV particles in two independent three-dimensional (3D) culture systems, the radial-flow bioreactor and the thermoreversible gelation polymer (TGP), but not in monolayer cultures. Immunoreactive enveloped particles, which are 50-60 nm in diameter and are surrounded by membrane-like structures, are observed in the culture medium as well as at the endoplasmic reticulum membranes and in dilated cytoplasmic cisternae in spheroids of Huh-7 cells. Infection of HCV particles is neutralized by anti-E2 antibody or patient sera that interfere with E2 binding to human cells. Finally, the utility of the 3D-TGP culture system for the evaluation of antiviral drugs is shown. We conclude that the replicon-based 3D culture system allows the production of infectious HCV particles. This system is a valuable tool in studies of HCV morphogenesis in a natural host cell environment.     

基因1b型HCV核心蛋白不同功能区域对HepG2细胞生长的影响

目的 研究基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株编码的核心蛋白(CORE):癌中心株(T)、癌旁株(NT)、C191(HCV-J6)及同一病毒株(T)编码的不同功能区域(1～172、1～126、1～58、59～126、127～172 AA)在HCV致病机制中的作用,为治疗HCV感染提供靶位.方法 将含有3个不同病毒株(T、NT及C191)及T不同功能区域的CORE真核表达质粒,转染到HepG2细胞,用流式细胞仪检测Annexin Ⅴ/PI,并用细胞生长实时观察仪观察细胞生长曲线.结果 基因1b型T、NT、C191和T不同功能区域的CORE均能诱导HepG2细胞凋亡和坏死且抑制了细胞的生长,其中,T诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长强于NT和C191, T的CORE的N端1～58 AA诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长均高于其他功能区域.结论 HCV基因1b型不同病毒株及同一病毒株编码的CORE不同功能区域的分子致病机制存在一定的差异,N端的1～58 AA在CORE的致病机制中起重要作用,可能是基因治疗的重要靶位之一.     

Hepatitis C virus (HCV) genotypes and the influence of HCV subtype 1b on the progression of chronic hepatitis C in Korea: a single center experience

Background/Aims

There is some controversy regarding whether or not hepatitis C virus (HCV) subtype 1b is more influential than non-1b subtypes on the progression of chronic hepatitis (CH) C to liver cirrhosis (LC) and hepatocellular carcinoma (HCC).

Methods

We retrospectively analyzed 823 patients with chronic HCV infection, including 443 CH patients, 264 LC patients, and 116 HCC patients, who were HCV RNA positive and HBsAg negative. These patients had not received any prior treatment with either interferon alone or a combination of interferon and ribavirin.

Results

HCV subtypes 1b (51.6%) and 2a/2c (39.5%) were the two most common genotypes. The proportions of genotypes 2 (2a/2c, 2b, and 2) and 3 were 45.8% and 1.1%, respectively. One case of genotype 4 was found. HCV subtype 1b (47.3%) was less common than the non-1b subtypes (52.7%) in non-LC patients, but its proportion (56.9%) was higher than that of non-1b subtypes (43.1%) in LC patients (P=0.006). The proportions of patients with HCV subtype 1b did not differ significantly between the LC (55.3%) and HCC (60.3%) groups. Older age, male gender, and the relative progression of liver damage (non-LC vs. compensated LC vs. decompensated LC) were significant risk factors for HCC, with odds ratios of 1.081 (95% confidence interval [CI], 1.056-1.106), 5.749 (95% CI, 3.329-9.930), and 2.895 (95% CI, 2.183-3.840), respectively. HCV subtype 1b was not a significant risk factor for HCC (odds ratio, 1.423; 95% CI, 0.895-2.262).

Conclusions

HCV subtypes 1b and 2a/2c were the two most common HCV genotypes. HCV subtype 1b seemed to be more influential than non-1b subtypes on the progression of CH to LC, but not on the development of HCC from LC.     

秦皇岛市各型肝炎病毒感染的血清流行病学研究

对１９９２年至１９９５年在秦皇岛市各医院住院的３２６例肝病患者进行各型肝炎病毒感染的血流流行病学分析，表明在慢性肝炎、肝硬化和原当性肝细胞肝癌中未检出甲型肝炎病毒抗体、乙型肝炎病毒在ＣＨ、ＬＣ和ＨＣＣ的感染率分别为７７．７８％，８４．２１％和９４．２９％，而在急性肝炎中的感染率为２１．５９％。