益气活血法对肾间质纤维化影响的实验研究

目的 观察益气活血中药拮抗肾间质纤维化的作用及对转化生长因子β1mRNA表达的影响.方法 将30只大鼠随机分假手术组(对照组)、模型组和治疗组(中药组),采用单侧输尿管梗阻(UUO)模型,术后第14天观察梗阻肾组织病理改变,应用免疫组织化学方法检测转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原的表达.结果 模型组TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达增加,肾间质病变加重,与对照组相比有显著差异(P＜0.05);治疗组与模型组相比,TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达下调,肾间质病变面积明显缩小,差异有显著性(P＜0.05).结论 益气活血中药可能通过下调TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达,从而阻抑肾间质纤维化的进展.     

苦参素对肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1、α-SMA合成的影响

目的 研究苦参素对肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1、α-SMA合成的影响,阐明其对肾小球系膜细胞的作用.方法 采用肾小球系膜细胞培养方法和甲基噻唑基四唑法(metyl thiazolyl tetronzolium,MTT)及免疫组化方法分别检测苦参素培养后肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1、α-SMA合成的影响.结果 一定浓度的苦参素能明显促进肾小球系膜细胞的增殖(P＜0.05),抑制TGF-β1的合成(P＜0.05),而对α-SMA合成无明显影响(P＞0.05).结论 一定浓度的苦参素可以抑制肾小球纤维化,保护肾小球系膜细胞,而对系膜细胞的表型转化无明显作用.     

氯沙坦及霉酚酸酯对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏的保护作用

目的:观察氯沙坦及霉酚酸酯对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏转化生长因子(TGF)β1、Ⅲ型胶原、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达介导的肾间质纤维化的作用. 方法:雌性SD大鼠30只,随机分为假手术组(Sham、UUO组、氯沙坦组(LSRT、霉酚酸酯组(MMF和联合用药组(L M).制备UUO大鼠模型后,LSRT组给予氯沙坦(50 mg·kg-1·d-1)灌胃、MMF组给予霉酚酸酯(25 mg·kg-1·d-1灌胃、L M组给予氯沙坦霉和霉酚酸酯(剂量同前)灌胃,用免疫组织化学方法检测术后14 d肾组织α-SMA、TGF-β1、Ⅲ型胶原表达量,并进行Masson染色评分.同时测定收缩压、尿蛋白及肌酐清除率. 结果:各组大鼠收缩压、尿蛋白及肌酐清除率均无差异(P＞0.05).与Sham组比较,UUO组及治疗组α-SMA 、TGF-β1、Ⅲ型胶原表达及Masson染色评分均增高,且UUO组高于各治疗组(P＜0.05),而联合治疗组低于单用药组(P＜0.05).结论:氯沙坦及霉酚酸酯可通过下调α-SMA、TGF-β1、Ⅲ型胶原表达减轻UUO术后肾组织间质纤维化,联合用药作用优于单独用药.     

L-精氨酸调节左向右分流所致肺动脉高压大鼠胶原代谢的研究

目的　探讨L 精氨酸 (L Arg)对高肺血流量所致肺动脉高压大鼠肺动脉胶原代谢的干预作用及其机制。方法　在大鼠行腹主动脉 下腔静脉分流造成的肺动脉高压模型基础上 ,给予L Arg灌胃 (1g·kg-1·d-1,11周 )。 11周后 ,观察肺血流动力学 ,采用免疫组织化学法检测大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达 ,以原位杂交法检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白α1(Ⅰ )mRNA、α1(Ⅲ )mRNA、基质金属蛋白酶 1(MMP 1)mRNA、抑制胶原降解作用的中性蛋白酶组织抑制剂 1(TIMP 1)mRNA的表达。结果　分流 11周后 ,肺动脉高压形成。分流组大鼠肺中、小型肺动脉中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α1(Ⅰ )、α1(Ⅲ )前胶原mRNA表达与对照组比较明显增加 ,同时TIMP 1mRNA、MMP 1mRNA表达、TIMP 1/MMP 1比值明显高于对照组 (P <0 .0 1)。然而 ,L Arg明显缓解了分流组大鼠肺动脉高压。分流 +L Arg组大鼠肺中、小型肺动脉中Ⅰ、Ⅲ型胶原、α1(Ⅰ )、α1(Ⅲ )前胶原mRNA表达较分流组明显降低 ,且TIMP 1mRNA、MMP 1mRNA表达、TIMP 1/MMP 1比值较分流组显著降低 (P值均 <0 .0 5 )。结论　L Arg通过减少细胞外基质 胶原的堆积 ,增加其降解 ,从而对高肺血流量所致肺动脉高压及肺动脉血管结构重建的形成有重要的调节作用。     

吡格列酮对肾小管上皮细胞转分化及CTGF表达的影响

目的 探讨吡格列酮能否负性调节转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞(TEMT),以及抑制TGF-β下游介质结缔组织生长因子(CTGF)表达,以阐明吡格列酮抗肾纤维化的作用及机制.方法 将体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白对照组、TGF-β3 ng/mL诱导组、TGF-β3 ng/mL+DMSO组、不同剂量吡格列酮阻断组.应用倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学、RT-PCR方法 定性及定量检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);RT-PCR方法 定量检测CTGFmRNA的表达;ELISA法测定培养细胞上清液中Ⅲ型胶原的含量.结果 ①TGF-β诱导组细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;免疫组织化学染色见大量α-SMA阳性细胞,与对照组相比,α-SMAmRNA表达量增加(P＜0.05);CTGF mRNA表达量增加(P＜0.05);细胞培养上清液中Ⅲ型胶原的含量增加(P＜0.05).②吡格列酮阻断组明显抑制TGF-β诱导的NRK52E细胞形态学改变;各剂量组均能抑制TGF-β诱导的α-SMA mRNA、CTGF mRNA表达及Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05),且呈剂量依赖(P＜0.05);③相关分析显示,CTGF mRNA与α-SMA mRNA、Ⅲ型胶原的分泌呈正相关(r=0.975,0.988,P均＜0.01).α-SMA mRNA与Ⅲ型胶原的分泌呈正相关(r=0.952,P＜0.01).结论 吡格列酮能够抑制TGF-β诱导的TEMT及Ⅲ型胶原的分泌,对肾间质纤维化具有负性调节作用;吡格列酮抑制TGF-β诱导的CTGF表达可能是其负性调节TEMT的机制之一.     

糜酶抑制剂在体外对肝星状细胞增殖及肝纤维化相关基因表达的影响

[目的]探讨糜酶抑制剂(Chy-I)在体外对肝星状细胞(HSC)增殖及肝纤维化相关基因表达的影响及作用机制.[方法]取HSC-T6细胞,分为对照组(DMEM)、模型组(TGF-β1)和Chy-I大、中、小剂量(TGF-β1+100 g/L Chy-I,TGF-β1+10 g/L Chy-I,TGF-β1+1 g/L Chy-I)组,检测Chy-I对HSC-T6细胞的增殖抑制率,采用Western blot法检测纤维化相关因子α-SMA及TGF-β1蛋白表达水平,应用实时定量PCR法检测α-SMA及I型胶原mRNA的表达情况.[结果]与模型组比较,Chy-I各剂量组HSC-T6细胞增殖明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖性;Western blot法检测结果显示,与模型组比较,Chy-I各剂量组HSC-T6细胞中α-SMA及TGF-β1蛋白表达明显受到抑制,亦呈剂量依赖性,Chy-I各组HSC-T6细胞内α-SMA及I型胶原mRNA表达水平明显降低.[结论] Chy-I在体外对HSC发挥抗肝纤维化作用,其机制认为可能与抑制HSC增殖水平及肝纤维化相关因子的表达有关系.     

Peroxiredoxin-1基因沉默对转化生长因子β1促进肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的 探讨Peroxiredoxin-1 (Prx-1)基因沉默对转化生长因子β1(TGF-β1)促进肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原的影响及其作用机制.方法 体外培养肺成纤维细胞分为4组:对照组(0.4％血清),TGF-β1组(5 μg/L),TGF-β1+阴性转染组(5μg/L TGF-β1+阴性对照siRNA),TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组(5 μg/L TGF-β1 +Prx-1 siRNA).利用脂质体Lipo2000将阴性对照siRNA和Prx-1 siRNA分别转染到TGF-β1+阴性转染组和TGF-β1+Prx-1 siRNA转染组的肺成纤维细胞中,转染48 h后用于后续实验.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染后各组的Prx-1 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化Akt(p-Akt)及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白水平,2,7-二氯荧光素二乙酸检测活性氧(ROS)水平.结果 (1) Prx-1 siRNA转染肺成纤维细胞后,TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组的Prx-1 mRNA表达明显降低.(2)与对照组比较,TGF-β1组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及pAkt蛋白水平均明显增加(0.34±0.06 vs.0.58±0.06、0.42±0.05 vs.0.56±0.06、2 988±379 vs.4 315±580和0.29±0.05 vs.0.66±0.07,差异有统计学意义(P＜0.05).与TGF-β1组比较,TGF-β1+阴性转染组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及p-Akt水平无明显变化(P＞0.05),但TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及p-Akt蛋白水平均进一步增高(0.58±0.06 vs.0.79±0.09、0.56±0.06 vs.0.77±0.08、4 315±580 vs.5 841±782和0.66±0.07 vs.0.93±0.15,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞生成ROS,并由此促进Akt的激活和肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原;而沉默Prx-1基因可激活ROS/Akt通路,从而有助于TGF-β1促进肺成纤维细胞合成胶原.     

红景天甙对低氧诱导肾小管上皮细胞转分化的作用研究

目的 观察红景天甙(salidroside,Sal)对氯化钴(cobaltous chloride,CoCl_2·6H_2O,Co)诱导的低氧状态下正常大鼠近端肾小管上皮细胞(normal rat kidney tubular epithelia cell,NRK52E)转分化的影响并分析其可能的机制.方法 体外培养NRK52E细胞,分为正常对照组,氯化钴低氧组,10、50、100 μmol/L不同浓度红景天甙组.观察低氧标志蛋白低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible foctor-1α,HIF-1α)的表达.倒置相差显微镜观察细胞形态变化;荧光免疫及细胞免疫法检测NRK52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达情况;RT-PCR检测NRK52E细胞α-SMA、转化生长因子-β_1(transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)mRNA的表达;Western blot蛋白印迹检测HIF-1α和α-SMA蛋白的表达;酶联免疫吸附法检测细胞上清液胶原Ⅰ(collagen Ⅰ,Col-Ⅰ)和纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)的含量.结果 100 μmol/L Co诱导NRK52E细胞表达HIF-1α.Co组细胞明显肥大、拉长,呈肌成纤维细胞外观.不同浓度Sal组细胞形态介于正常与Co组之间.CO组α-SMA基因、蛋白和TGF-β_1 mRNA表达量较对照组升高(P＜0.05),不同浓度Sal组α-SMA基因、蛋白和TGF-β1 mRNA表达量较Co组减少(P＜0.05).Co组细胞上清液Col-Ⅰ和FN的含量较对照组增加(P＜0.05),不同浓度Sal组Col-Ⅰ和FN的含量明显下降(P＜0.05),以高剂量组最为明显.结论 Sal可在一定程度上改善Co诱导的低氧状态和细胞转分化,减少细胞外基质的增加.其机制可能是通过抑制TGF-β_1和HIF-1α的表达实现的.     

β-catenin蛋白敲除对肺成纤维细胞活性影响的实验研究

目的 探讨β-catenin蛋白敲除对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞（CCC-REPF-1）活性的影响及其机制.方法 体外培养大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1）,应用CCK-8法、Western blot、RT-PCR技术检测细胞增殖、活性及功能表达,进行统计学检验.结果 TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn蛋白表达量、α-SMA、col Ⅰ、colⅢmRNA表达量明显高于正常细胞组,而E-cadherin蛋白表达量明显低于正常细胞组;F-TrCP-Ecad转染组上述值明显低于TGF-β1刺激组（P＜0.01）,E-cadherin蛋白表达量高于TGF-β1刺激组（P＜0.01）;TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组比较无明显差异.结论 TGF-β1是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子,β-catenin途径是TGF-β1发挥作用的重要信号通路,β-catenin蛋白敲除通过阻断该信号途径,阻止肺纤维化进程.     

间歇性高糖对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52EA转分化的影响

目的:探讨间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52EA转分化干预作用。方法:NRK-52E细胞分为空白组、正常葡萄糖组、高糖组、间歇性高糖组,分别作用72 h后,Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶-2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达;CM2H2DCFDA试剂盒检测活性氧(ROS)含量。结果:高糖组及间歇性高糖组NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达均上调;间歇性高糖组TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达水平较高糖组高(P均<0.05),其ROS含量也显著高于高糖组(P<0.01)。结论:间歇性高糖能通过氧化应激诱导肾小管导管上皮细胞表达TGF-β1、MMP2,并促进NRK-52EA细胞转分化为α-SMA细胞。     

Meprinα对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原合成的调节作用

目的观察Meprinα对转化生长因子(TGF)-β1介导的成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的调节作用。方法原代培养肺成纤维细胞,采用TGF-β1诱导,并予以重组Meprinα及放线酰胺素(Actinonin)预处理。免疫细胞化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,免疫印迹法检测Meprinα、I型胶原、α-SMA的表达。结果 TGF-β1能够促进肺成纤维增殖和迁移能力,显著上调I型胶原、α-SMA的表达,同时降低Meprinα的表达(P<0.05)。免疫印迹结果显示,予以Meprinα预处理能够显著抑制TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05);予以Actinonin预处理,则能够显著促进TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05)。结论 Meprinα具有抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的作用。     

晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E的转分化干预作用。方法：大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组（不给葡萄糖）、高糖组（25mmol/L葡萄糖）、AGEs干预组（100mg/LAGEs）、高糖AGEs干预组（100mg/LAGEs＋25mmol/L葡萄糖）,培养72h后,用Westernbolt检测转化因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在NRK-52E细胞的表达,活性氧（ROS）含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果：高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达,AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP表达,提高ROS含量。结论：AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。     

"抗肝纤268方"对肝纤维化的治疗作用

目的探讨"抗肝纤268方"对肝纤维化的影响及机理.方法制备肝纤维化模型鼠,采用"抗肝纤268方"高、低剂量治疗3周,对照组用秋水仙碱治疗,Masson染色后光镜下统计肝内纤维成分的数量(IOD值),免疫组化染色后统计肝内TGF-β1、α-SMA 、FN、LN、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等的数量(IOD值).结果模型组大鼠FN、LN、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1、α-SMA,以及肝内纤维成分等的IOD值与正常组比较均增高,差异有显著性(P<0.05或P＜0.01)."抗肝纤268方"低、高剂量以及秋水仙碱治疗3周后,以上指标的IOD值与模型组比较,差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01).低剂量组与高剂量组、对照组比较,差异有显著性(P＜0.05).结论 "抗肝纤268方"可调节TGF-β1的数量、进而影响α-SMA的数量、从而减少细胞外基质(ECM)数量,是其抗肝纤维化的机理.     

苦参素治疗对慢乙肝患者TGF-β1、TNF-α、HA、PcⅢ水平的影响

目的探讨苦参素在慢性乙型肝抗肝纤维化的作用机理.方法采用ELISA和RIA方法对治疗 Ⅰ组和治疗Ⅱ组(苦参素组)治疗前及治疗6月后的慢性肝炎轻度、肝炎中度、肝炎重度及肝硬化246例患者血清转化生长因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(TNG-α)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PaⅢ)含量进行测定,并设立35例健康献血人员作为正常组.结果治疗前两组患者血清TGF-β1、TNF-α、HA、PcⅢ均不同程度的升高,与正常组相比差异显著(P＜0.05或P＜0.01);治疗后均有不同程度的降低,治疗Ⅱ组治疗后与治疗前相比明显下降(P＜0.05或P＜0.01),并与治疗Ⅰ组在慢性肝炎中度、肝炎重度、肝硬化间差异显著(P＜0.05或P＜0.01).结论苦参具有逆转肝纤维的作用,有部分机制通过抑制TGF-β1、TNF-α的分泌,并且具有良好的耐受性.     

转化生长因子-β1及其受体的表达与大鼠肝纤维化关系的研究

目的：探讨肝纤维化形成过程转化生长因子-β1(TGF-β1)及其受体的表达对胶原合成的影响。方法：采用免疫组化和斑点杂交技术,观察实验性大鼠肝纤维化过程肝内TGF-β1、TGF-β RⅡ和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白质表达的动态变化。结果：随着肝纤维化程度的加重,肝内TGF-β1、TGF-β RⅡ和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白质表达均明显增加,组间比较均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。TGF-β1与Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白质表达之间均呈明显正相关;TGF-β RⅡ与Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白质表达之间也均呈正相关。结论：TGF-β1是肝纤维化的重要介质,TGF-β RⅡ表达增加是肝纤维化发病机制中的重要环节。     

bFGF反义寡核苷酸对大鼠肺成纤维细胞增殖信号通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸(AODN)对大鼠肺成纤维细胞增殖、转化信号通路的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞,分为4组:对照组(未转染肺成纤维细胞);TGF-β1组(未转染肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+AODN组(转染AODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+RODN(正义寡核苷酸)组(转染RODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激)。每组设3复孔,并作细胞爬片,镜下计数肺成纤维细胞数量,绘制生长曲线。MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率。免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。通过ELISA法检测培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量。用RT-PCR法分析肺成纤维细胞Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果:1细胞计数显示:TGF-β1+RODN组各时段成纤维细胞的数目均较对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组明显增多(P<0.05);TGF-β1+AODN组中成纤维细胞增殖数比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。2MTT结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞光密度值明显比TGF-β1组减低(P<0.05)。3免疫细胞化学染色结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞与对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组比较,α-SMA染色的平均光密度值(IOD)明显增加(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞α-SMA染色的平均光密度值(IOD)比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。4 ELISA法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。5RT-PCR法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显比TGF-β1组明显减低(P<0.05);TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad7mRNA表达明显低于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad7 mRNA表达比TGF-β1组明显增加(P<0.05)。结论:bFGF反义寡核苷酸可抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及胶原合成,bFGF反义寡核苷酸可能通过下调TGF-β1-Smad信号通路来发挥作用。     

白血病抑制因子对肾间质成纤维细胞活化的影响

目的 研究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)对肾间质成纤维细胞活化的干预作用.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞,分对照组、转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理组及TGF-β1和LIF共处理组,电镜下观察细胞形态变化,通过RT-PCR及Western blot检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达的改变,双抗体夹心ABC-ELISA检测细胞上清Ⅰ型胶原.结果 TGF-β1引起成纤维细胞激活,产生形态学改变,α-SMA表达增高(P<0.01),Ⅰ型胶原产生增加(P<0.01).与TGF-β1处理组相比,LIF干预组形态学改变不明显,LIF能干预TGF-β1引起大鼠肾间质成纤维细胞α-SMA表达和Ⅰ型胶原产生.结论 LIF可以抑制TGF-β1引起的肾间质成纤维细胞激活.     

转化生长因子-β1促血管内皮细胞向间质细胞转化的作用研究

目的 观察转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)促进内皮细胞向间质细胞转化[endothelial-mesenchymal (myofibroblast) transition,EnMT]的效应,探讨肌成纤维细胞的来源以及纤维化疾病发生的新机制.方法 分离培养人脐静脉内皮细胞,采用不同浓度的TGF-β1(0、10、25、和50 ng/ml)刺激细胞 72 h后,倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光方法检测第Ⅷ因子相关抗原和α-SMA表达变化,RT-PCR检测VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin),α-SMA和Ⅰ型胶原基因表达变化. 结果 正常对照组内皮细胞呈铺路石样生长,TGF-β1刺激组内皮细胞由铺路石样形态向梭形转化.免疫荧光检测可见对照组含有少量FⅧ,α-SMA双阳性细胞.TGF-β1组FⅧ,α-SMA双阳性细胞明显增多,并且具有明显的浓度依赖性(P<0.05,P<0.01).RT-PCR检测结果显示,TGF-β1刺激导致内皮细胞特异性标记物VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)基因的表达显著减少(P<0.05),随着TGF-β1刺激浓度的增加,VE-钙粘蛋白基因表达呈明显的下降趋势;相反,内皮细胞间质性标记物α-SMA和I型胶原基因的表达显著增加(P<0.05,P<0.01),并且具有明显的浓度依赖性.结论 TGF-β1刺激内皮细胞后,细胞表型和功能均表现为间质细胞特性,提示TGF-β1具有促进内皮细胞向间质细胞转化(EnMT)的作用,并且其促EnMT效应具有明显的浓度依赖性.     

灯盏细辛对低氧环境下肺成纤维细胞Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1表达的干预作用

目的研究灯盏细辛对低氧环境下肺成纤维细胞Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶1(MMP1)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)表达的影响。方法以人胚肺成纤维细胞系MRC-5为研究对象,Western blot法检测常氧、低氧、丝/苏氨酸激酶抑制剂星型孢菌素(straurosporine,SP)、灯盏细辛作用下MRC-5缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)、Ⅰ型胶原前α1链(pro-col1α1)、p-smad2蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1蛋白的含量。结果体外培养的MRC-5,常氧环境下细胞内表达一定的pro-col1α1、p-smad2蛋白,几乎不表达HIF-1α,细胞外基质有较低水平的Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1蛋白表达;低氧环境下细胞内pro-col1α1、p-smad2蛋白、HIF-1α和细胞外基质Ⅰ型胶原、MMP1和TIMP1均较常氧组表达增加(P<0.05);SP(5nmol/L)预处理细胞30min与单纯低氧组比较,其胞内的p-smad2蛋白、pro-col1α1和基质中的Ⅰ型胶原、TIMP1降低(P<0.05),而基质中的MMP1表达增加(P<0.05);灯盏细辛组(12.5μg/mL、50μg/mL)与单纯低氧组比较其胞外的Ⅰ型胶原、MMP1、TIMP1蛋白和胞内的HIF-1α、pro-col1α1和p-smad2蛋白表达均有降低(P<0.05)。结论灯盏细辛可降低低氧环境下HIF-1α蛋白的表达,并部分通过p-smad2信号通路抑制Ⅰ型胶原、TIMP1蛋白生成。     

二苯乙烯苷对TGF-β1诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制

探讨二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷,TSG)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(CFB)增殖和胶原合成的影响,并研究其相关机制。用消化法培养新生SD大鼠CFB,建立TGF-β1诱导新生大鼠CFB纤维化模型。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测CFB增殖情况;乳酸脱氢酶(LDH)法检测药物对细胞毒性作用;羟脯氨酸测定检测CFB胶原含量;流式细胞仪测定细胞周期;Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COL Ⅲ)、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、p-ERK、ERK、p-P38、P38、p-JNK、JNK的蛋白表达。结果表明,终浓度为0.1~100 μmol/L的TSG无明显细胞毒性作用;在一定浓度范围内,TSG可明显抑制TGF-β1诱导的CFB增殖和胶原合成,抑制细胞由G₀/G₁期向S期的转变,抑制TGF-β1诱导的CFB核内PCNA的蛋白表达,降低α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ的过度表达,并抑制TGF-β1诱导的Smad3、ERK和P38的磷酸化。因此推测一定浓度的TSG能抑制TGF-β1诱导的CFB增殖和胶原合成,其机制可能与干预Smad3、ERK和P38信号通路有关。