蛔虫过敏原ABA-1融合基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

背景:利用蛔虫基因融合技术,可将过敏原ABA-1的主要基因进行融合。目的:利用大肠杆菌表达系统重组表达蛔虫主要过敏原ABA-1融合蛋白。方法:从Gene Bank和Protein Database中获取蛔虫主要过敏原ABA-1基因和蛋白序列,选定其中的ABA-1B1,ABA-1A2与ABA-1A1基因重组为融合基因BAA,经密码子优化后,全基因合成目的基因BAA并构建于表达载体PET-44a上,经KCM法转化入大肠杆菌JM109中进行克隆,PET-44a/BAA经NdeⅠ和PstⅠ双酶切及DNA测序正确后,转化入大肠杆菌Rosetta Blue TM中,经IPTG诱导表达。表达蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,通过Western blot和氨基酸测序鉴定目的蛋白。结果与结论:大肠杆菌的融合蛋白BAA表达量约占总蛋白的40%,纯化后蛋其白纯度可达90%左右。Western Blot结果显示在相对分子质量45000处可见一特异目的条带,氨基酸测序显示N端15个氨基酸与目的蛋白完全相同。结果证实,融合蛋白BAA在大肠杆菌中得到高效的表达。     

肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体的构建、表达及纯化

背景:研究表明肺表面活性物质蛋白基因缺陷导致肺表面活性物质蛋白的结构发生变化。早期检测肺表面活性物质的含量对于预测肺部疾病的发生意义重大。目的:克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因,构建原核表达载体PET-28a/SP-C,并纯化SP-C蛋白。方法:提取正常人肺组织总RNA,RT-PCR技术获得SP-C cDNA序列,纯化后的SP-C基因插入至中间载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-SP-C,重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的SP-C cDNA,将质粒PET-28a同样经过双酶切后纯化回收得到与SP-C cDNA具有相同黏性末端的质粒片段,将具有黏性末端的SP-C cDNA与PET-28a定向连接后得到重组质粒PET-28a/SP-C。然后将鉴定正确的PET-28a/SP-C重组质粒转入BL21中诱导表达。结果与结论:酶切鉴定及核苷酸序列测序证实扩增的SP-C cDNA及其重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,在5000～7500bp和250～1000bp处可检测到2条条带。核苷酸序列测序结果证实,质粒中插入基因长597bp,为一开放阅读框架,与GeneBank中公布的人SP-C cDNA序列相符。Western-blot检测结果显示,纯化后的SP-C蛋白在相对分子质量约27000处出现1条新生条带,与预期的大小一致。结果证实,实验成功克隆人SP-C基因并插入至质粒PET-28a中,构建了PET-28a/SP-C重组质粒,将其体外转化至BL21后可以表达SP-C蛋白。     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a（＋）,并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化

目的克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白。方法RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入T Easy Vector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从T Easy vector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET 32a( )原核表达载体中构建pET 32a( )-MFoxp3表达载体。用IPTG诱导转化pET 32a( )-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白。结果经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a( ),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性。结论构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白。     

p21Ha-ras原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

目的：构建PET-28a（＋）Ha-ras原核表达质粒，并表达、纯化得到p21ras蛋白，为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础。方法：培养人肝癌细胞株7703，提取总RNA，通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA，然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras．重组质粒PMD-18T vector-Ha-ras经过BamH I和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA．将PET-28a（＋）同样经过BarnH I和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段，将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a（＋）定向连接，构建出重组质粒PET-28a（＋）-Ha-ras，经酶切鉴定，并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的PET-28a（＋）．Ha-ras转入感受态BL-21（DE3）中诱导表达，利用组氨酸“标签”（His-Tag）对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化。结果：测序分析证实，克隆入PET-28a（＋）的Ha-ras序列与Genbank登录号为“NM_005343”的Ha-ras cDNA序列一致，将重组质粒PET-28a（＋）．Ha-ras转化BL21（DE3），用IPTG诱导目的蛋白表达。SDS、PAG和蛋白纯化结果表明，PET-28a（＋）-Ha-Ras在E-coli中获得可溶性高表达，经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白。结论：成功构建了原核表达载体PET-28a（＋1）-Ha-ras，并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白，从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础。     

核包膜蛋白gp210自身抗原基因的克隆、表达、纯化及其临床应用

目的研究核包膜蛋白gp210基因在大肠杆菌中的稳定表达、纯化和免疫学活性鉴定。方法从人外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增gp210蛋白中含优势表位的基因片段。将该段基因克隆入PET-30a表达载体并转化到大肠杆菌BL21中表达。融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE电泳及ELISA方法进行鉴定。结果在原核表达载体中成功构建了PET30a-gp210重组体。重组体诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子量大约69 kD处有gp210融合蛋白的高效表达,经纯化获得纯度达90%的表达蛋白。ELISA检测结果显示该重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论应用基因工程方法,获得了gp210重组蛋白,为检测抗gp210抗体提供了特异性抗原,也为临床将抗gp210抗体作为PBC的特异性诊断指标奠定了基础。     

人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法 采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果 重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论 作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。     

结核菌抗原基因Rv3881c在大肠杆菌中的高效表达分析

目的：从结核分枝杆菌基因组克隆Rv3881c基因并重组入pET24b载体，在大肠杆菌中进行融合表达。重组蛋白经纯化后通过Western blot分析初步鉴定其抗原性和特异性。方法：提取H37Rv标准株的基因组DNA。以基因组DNA为模板PCR扩增出Rv3881c基因，连接到pGEMT上。经过筛选鉴定后。将重组子测序；将测序正确的基因双酶切后连接到pET24b载体上，筛选得到重组载体pET24b-48；在BL21菌株中优化表达并采用金属鏊合层析方法纯化蛋白：选取6例结核病阳性临床血清标本和6例健康人血清标本进行Western blot分析。结果：发现从保存的H37Rv菌株克隆得到了读码框完全正确的Rv3881c基因。它在大肠杆菌中可以高效表达。表达量约占细菌总蛋白的20％以上。重组蛋白不与健康人血清反应。可与结核标本血清有较强的免疫印迹反应。结论：重组Rv3881c具有较好的特异性。该抗原有潜力成为检测结核的有效抗原组分之一。     

融合蛋白TRX-hJagged1原核表达载体的构建及其在BL21中的表达

本研究旨在构建原核表达载体并原核表达Notch配体Jagged1。构建不同长度但均包含DSL区的原核表达载体pET-hJagged1,将构建重组原核表达载体pET—hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白TRX—hJagged1在上清中有较大量表达。诱导工程菌并以镍柱纯化对可溶性的目的蛋白进行纯化。结果表明,成功构建了原核表达载体pET—ldaggedl（Bg1Ⅱ）、pET—hJagged1（Hind1）及pET-hJagged1（stuI）,但仅pET—hJagged1（StuI）表达可溶性的TRX—hJagged1。通过镍柱纯化获得了较单一的TRX—Jagged1蛋白,WesternBlot证实了其为目的蛋白。结论：成功地构建了原核表达载体pET—hJagged1,并在原核表达系统表达了TRX-Jagged1融舍蛋白,为进一步研究Jagged1在淋巴造血系统中的作用奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景:骨形态发生蛋白2是诱导成骨关键物质,参与调节从细胞增殖、决定种系分化方向到细胞死亡等一系列的生物过程。目的:利用AdMax系统构建人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法:以人cDNA为模板PCR扩增人骨形态发生蛋白2基因,转化E.coli感受态细胞,经菌落PCR鉴定阳性转化子、阳性克隆测序无误后,扩增、抽提。将带有目的基因的腺病毒表达载体和携带有腺病毒大部分基因的辅助包装质粒共转染293细胞进行病毒包装扩增,PCR检测目的基因、Western Blot检测目的蛋白及终点稀释法检测病毒滴度。结果与结论:PCR获得长度为1223bp的人骨形态发生蛋白2目的基因片段,同源重组表达载体经阳性克隆PCR及测序鉴定,结果正确。293细胞内包装、扩增,经Westernblot及PCR鉴定无误后,获得病毒滴度为5×1013pfu/L的重组腺病毒。实验成功构建携带有人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体。     

单纯疱疹病毒2型全长糖蛋白D抗原的原核表达及抗原性分析

目的:构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)全长糖蛋白D(gD)基因原核表达质粒,研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达,并鉴定重组蛋白的gD抗原性。方法:提取病毒DNA,PCR扩增出gD基因,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠杆菌BL21。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后,IPTG诱导表达融合蛋白GST-gD,并进行免疫学鉴定。结果:获得了gDDNA。测序鉴定表明,该序列与Gen Bank中的序列一致,gD基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD经IPTG诱导后能在大肠杆菌中高效表达,Western Blotting证实,该蛋白具有天然gD抗原性。结论:成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD,在大肠杆菌中获得了有效表达,并证实融合蛋白具有gD免疫原性。为进一步研究gD蛋白的免疫学特性,制备gD亚单位疫苗和单克隆抗体奠定了基础。     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

背景:SIRT1基因在细胞能量代谢、凋亡及衰老过程中发挥极重要的作用,另有研究发现SIRT1可能在炎症反应方面起着调控作用。目的:构建SIRT1特异性的shRNA慢病毒载体,并初步检测其对THP-1细胞SIRT1基因的抑制效应。方法:设计SIRT1靶点特异性的寡核苷酸序列,连接到经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒,再转染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR实验及WesternBlot检测对SIRT1靶基因的抑制情况。结果与结论:阳性克隆PCR及测序证实SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR及Western Blot检测该载体在mRNA和蛋白水平能抑制THP-1细胞的SIRT1表达。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定

目的构建编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区基因片段的原核表达载体,并表达、纯化及鉴定蛋白。方法从临床标本中分离鉴定MRSA,设计针对编码PBP2a转肽酶区基因片段的引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,克隆至pET28a(+)载体,双酶切鉴定并测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS株;用0.7mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,利用Ni亲和层析技术纯化目的蛋白;蛋白免疫印迹法(WB)鉴定重组蛋白。结果重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切,产物在预期大小处出现条带,测序结果显示有两个碱基突变,无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和WB鉴定,在相对分子质量38×103处可见一新生蛋白条带。结论成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体,并获得了高效表达,制备了高纯度的目的蛋白。     

构建重组人pET-32a-瘦素高效的表达载体

背景：瘦素的功能是作为脂肪细胞体脂量的信号来认识的,作为体内的能量平衡信号反馈到下丘脑,与其中各部位神经元的受体结合后参与调节进食、饮水、能量代谢。目的：构建原核重组表达载体pET-32a-瘦素并检测其在大肠杆菌BL21中的高效表达。方法：取人脂肪组织,RT-PCR法制备瘦素目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pMD18T与pET-32a原核表达载体,双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌BL21株诱导其表达,SDS-PAGE电泳分离鉴定,表达产物变性复性后,间接酶联免疫吸附法检测抗原反应原性。结果与结论：实验成功扩增出520bp的瘦素目的基因并构建了原核重组表达载体pET-32a-瘦素;测序结果与GenBank收录序列相一致;目的蛋白pET-32a-瘦素呈极高效表达,占总蛋白的50%以上;变性复性后抗原反应原性较复性前明显提高（P〈0.01）。结果证实,实验成功构建原核重组高效表达的载体pET-32a-瘦素,并提高其抗原反应原性。     

人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用

目的原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用。方法通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbC-pp150-gp52融合蛋白并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的特异性和应用价值。结果纯化获得的融合蛋白DsbC-pp150-gp52经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份临床阳性血清和60份健康人血清。其中以酶标记DsbC-pp150-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率96.7% ,阴性检出率100%,初步验证DsbC-pp150-gp52融合肽具有非常好的抗原特异性。结论融合蛋白DsbC-pp150-gp52在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,获得的高纯度重组融合蛋白具有抗原性和特异性强的特点,采用IgM捕获ELISA的实验方法,可开发检测试剂盒用于风疹病毒的早期检测。     

Chromosomal integration of a cephalosporinase gene from Acinetobacter baumannii into Oligella urethralis as a source of acquired resistance to beta-lactams

Clinical Oligella urethralis isolate COH-1, which was uncommonly resistant to penicillins and narrow-spectrum cephalosporins, was recovered from a 55-year-old patient with a urinary tract infection. Shotgun cloning into Escherichia coli and expression experiments gave recombinant clones expressing either an AmpC beta-lactamase-type phenotype of resistance or a carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamase-type phenotype of resistance. The AmpC beta-lactamase identified (ABA-1), which had a pI value of 8.2, had 98% amino acid identity with a chromosomally encoded cephalosporinase of Acinetobacter baumannii. A 820-bp insertion sequence element, ISOur1, belonging to the IS6 family of insertion sequence elements, was identified immediately upstream of bla(ABA-1), providing a -35 promoter sequence and likely giving rise to a hybrid promoter region. The carbenicillin-hydrolyzing beta-lactamase identified (CARB-8), which had a pI value of 6.4, differed from CARB-5 by two amino acid substitutions. Hybridization of CeuI fragment I-restricted DNA fragments of O. urethralis COH-1 with bla(ABA-1)-, bla(CARB-8)-, and 16S rRNA-specific probes indicated the chromosomal integration of the beta-lactamase genes. PCR and hybridization experiments failed to detect bla(CARB-8)- and bla(ABA-1)-like genes in three O. urethralis reference strains, indicating that the beta-lactamase genes identified were the source of acquired resistance in O. urethralis COH-1. This is one of the few examples of the interspecies transfer and the chromosomal integration of a gene encoding a naturally occurring beta-lactamase.