EDN1基因5′上游AP-1顺式调控元件在同型半胱氨酸诱导HUVECs EDN1基因转录中的作用

目的： 探讨EDN1基因5′上游AP-1顺式调控元件在同型半胱氨酸(Hcy)诱导HUVECs EDN1基因转录中的作用。方法：用荧光探针DCF检测HUVECs内活性氧的含量；用RT-PCR法检测EDN1mRNA的表达，用Western blotting法测定c-jun/AP-1蛋白的表达；同时用双抗夹心法测定HUVECs上清液中EDN1的分泌；利用重组质粒的瞬时转染技术观察了HUVECs的AP-1报告基因的活性。结果：Hcy能明显增加HUVECs ROS的生成，促进 EDN1的分泌和提高EDN1mRNA的表达；瞬时转染分析实验结果显示Hcy能明显诱导质粒pGL3-EDN1-AP-1(-115/+135)荧光素酶的表达,但对质粒pGL3-EDN1-AP-1(-115/+135)的突变体pGL3-EDN1-AP-1 MU(-115/+135) 荧光素酶的基础表达及Hcy的诱导作用均明显降低。结论：推测Hcy可能改变HUVECs内的氧化还原状态，促进ROS的释放，激活核转录因子AP-1，通过EDN1基因中AP-1顺式作用元件调控该基因转录。     

mmLDL对人脐静脉内皮细胞PAI-1表达的影响及其转录调控机制

目的:探讨弱氧化修饰低密度脂蛋白(mmLDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)PAI-1活性和mRNA表达的影响及其转录调控机制。方法:人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定。用发色底物法测定PAI-1活性。Northern印迹分析法检测PAI-1mRNA的水平。采用基因重组技术构建含不同长度PAI-1 5'上游序列的荧光素酶报告基因质粒, 瞬时转染进入内皮细胞, 并检测荧光素酶的表达情况。 利用PCR和测序技术, 对构建质粒上AP-1元件进行定点突变。Western blot印迹杂交检测内皮细胞核内激活蛋白-1(AP-1)蛋白水平。结果:50 mg/L mmLDL诱导HUVECs PAI-1活性和mRNA表达量明显增高, 同时提高核内AP-1蛋白水平。mmLDL显著诱导构建质粒pGL3-PAI-1-1509/+90和pGL3-PAI-1-823/+90的荧光素酶活性, 但对质粒pGL3-PAI-1-553/+90和pGL3-PAI-1-47/+90诱导作用不明显。当PAI-1 5'上游序列的3个AP-1元件突变后, mmLDL的诱导作用明显降低。结论:(1)mmLDL增强血管内皮细胞 PAI-1活性与mRNA表达;(2)PAI-1活性提高与其mRNA表达增加呈正相关;(3) PAI－1 5'上游序列中3个AP-1元件在mmLDL对PAI－1诱导中具有重要调控作用。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

植物雌激素α-ZAL抑制同型半胱氨酸诱导HUVECs的ET-1基因表达及抗氧化机制

目的:通过氧应激(ROS)信号转导通路探讨植物雌激素α-ZAL对同型半胱氨酸(HCY)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中ET-1基因表达的抑制作用及抗氧化机制。方法:用荧光探针DCF检测HUVECs内ROS的含量;采用RT-PCR方法对ET-1mRNA的表达进行分析,运用WesternBlot法测定细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-jun/AP-1)的表达;同时测定HUVECs上清液中ET-1的浓度,利用瞬时转染技术观察HUVECs的AP-1报告基因的活性。结果:α-ZAL能降低AP-1的活性,抑制由HCY诱导ET-1的分泌和ET-1mRNA的表达,并可能通过抗氧化作用阻断由HCY诱导的HUVECsROS的产生。结论:α-ZAL能抑制HCY诱导HU-VECs的ET-1基因表达,推测可能是α-ZAL减弱了氧应激(ROS)、抑制了蛋白激酶ERK的激活和调节ET-1基因上核转录因子AP-1的表达。     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

人支气管上皮细胞GCLC基因调控区ARE及E-box顺式调控元件调控功能的研究

目的 通过对人γ-谷氨酰半胱氨酸酶催化亚单位(GCLC)基因调控区的ARE及E-box顺式调控元件诱导缺失突变,研究它们在人支气管上皮细胞内对GCLC基因转录调控功能的影响.方法 应用PCR方法克隆人GCLC基因调控区的大部分核苷酸序列,构建表达虫荧光素酶报告基因的野生型质粒PL45.采用PCR重叠延伸产生特异位点诱变的方法对ARE及E-box顺式调控元件进行缺失突变,构建相应的突变型质粒PLdel-ARE及PLdel- E-box.通过瞬时基因转染方法将上述质粒转染人支气管上皮细胞系16HBE,观察基因突变后的基因转录调控功能.结果 质粒PL45的虫荧光素酶相对活性值为9949.75±1441.33、质粒PLdel-ARE的虫荧光素酶相对活性值为21258.75±1563.64、质粒PLdel-E-box的虫荧光素酶相对活性值为17082.00±89.51.与野生型质粒PL45相比,PLdel-ARE、PLdel-E-box突变型质粒表达的虫荧光酶相对活性值显著上升.结论 ARE及E-box顺式调控元件具有负性调控作用.     

5'上游序列对TNFα诱导内皮细胞血小板源生长因子-B链基因转录的调控作用

目的和方法:为探讨人血小板源生长因子(PDGF)-B链基因5'上游序列在TNFα诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用,本研究将构建的一系列含人PDGF-B链基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,与内参照质粒pSV-β-Gal共转染培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别检测了不同浓度和不同持续时间TNFα作用下转染内皮细胞荧光素酶比活性,观察了5'上游序列的定向删切对TNFα诱导内皮细胞PDGF-B链基因转录的影响.结果和结论:不同浓度TNFα处理转染(重组报告基因质粒pSIS-1758/+43Luc)内皮细胞18h,荧光素酶的表达均有增加,在TNFα为200U/mL、400 U/mL和800 U/mL时,荧光素酶活性呈浓度依赖性增加(分别为P＜0.05,P＜0.05和P＜0.01);200U/mL TNFα分别处理9 h、18 h、36 h和72 h后,内皮细胞荧光素酶均有增加,自18 h开始其荧光素酶的表达量呈时间依赖性增加(分别为P＜0.05,P＜0.05和P＜0.01);在PDGF-B链基因上游序列-1758/+43 bp,-402/+43 bp或-189/+43 bp存在下,TNFα可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显增加,而在-84/+43 bp和-52/+43 bp存在时TNFα组与对照组荧光素酶表达量无明显差异,提示PDGF-B链基因上游序列-189/-85 bp范围内存在TNFα诱导反应的顺式调控元件.     

人支气管上皮细胞GCLC基因调控区ARE及E-box顺式调控元件调控功能的研究

目的通过对人γ-谷氨酰半胱氨酸酶催化亚单位(GCLC)基因调控区的ARE及E-box顺式调控元件诱导缺失突变,研究它们在人支气管上皮细胞内对GCLC基因转录调控功能的影响。方法应用PCR方法克隆人GCLC基因调控区的大部分核苷酸序列,构建表达虫荧光素酶报告基因的野生型质粒PL45。采用PCR重叠延伸产生特异位点诱变的方法对ARE及E-box顺式调控元件进行缺失突变,构建相应的突变型质粒PLdel-ARE及PLdel-E-box。通过瞬时基因转染方法将上述质粒转染人支气管上皮细胞系16HBE,观察基因突变后的基因转录调控功能。结果质粒PL45的虫荧光素酶相对活性值为9949.75±1441.33、质粒PLdel-ARE的虫荧光素酶相对活性值为21258.75±1563.64、质粒PLdel-E-box的虫荧光素酶相对活性值为17082.00±89.51。与野生型质粒PL45相比,PLdel-ARE、PLdel-E-box突变型质粒表达的虫荧光酶相对活性值显著上升。结论ARE及E-box顺式调控元件具有负性调控作用。     

人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1基因P7启动子调控的报告基因载体的构建及鉴定

应用PCR方法从人单核细胞系THP-1基因组DNA扩增人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase1, ACAT1)基因 P7启动子全长片段,进行TA克隆,经双酶切、测序鉴定阳性克隆.将该基因亚克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer,用DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)法将重组质粒pGL3E-P7瞬时转染入单核细胞THP-1,检测其活性,证明pGL3E-P7能在体外表达荧光素酶.人ACAT1基因P7启动子调控的荧光素酶报告基因表达载体的成功构建,为研究动脉粥样硬化过程中ACAT1基因的转录调控机制提供新手段.     

先兆子痫患者HLA-DQA1、-DQB、-DPA1基因多态性

目的：探讨人类白细胞抗原HLA-DQA1、-DQB1、-DPA1基因多态性与先兆子痫发病的关系。方法：采用序列特异性引物技术（PCR-SSP） 对46例先兆子痫患者和105例正常孕妇及其新生儿进行HLA-DQ-DPA1等位基因分型。结果：所有标本共检出11种HLA-DQA1基因表型、16种HLA-DQB1基因表型、6种HLA-DPA1基因表型。先兆子痫患者HLA-DQB1＊0301基因频率高于正常孕妇，差异有显著性（Pc=0．032，RR=2．43，AR=0．30），其余各基因表型频率两组比较差异均无显著性。结论：HLA-DQB1＊0301基因可能是一种先兆子痫发病的易感基因。     

HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1, -DPA1 and -DPB1 genes in Japanese multiple sclerosis patients

Japanese MS patients and controls were examined for the distribution of HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1, -DPA1 and -DPB1 alleles using in vitro amplification of genomic DNA and probing with sequence-specific oligonucleotides. No significant difference in frequency of the examined alleles was observed among the two groups. This is in contrast to Norwegian MS patients, where an association to a combination of certain DQA1 and DQB1 alleles has previously been demonstrated.     

Comprehensive sequence analysis of HLA-DQA1 and -DQB1 alleles and characterization of DRB1-QAP-DQA1-DQB1 haplotypes

It is well known that both chain and β chain of HLA-DQ are highly polymorphic. However the polymorphisms outside the hypervariable region were not fully examined so far. To further clarify the polymorphisms in DQ genes, we determined the nucleotide sequences of full length cDNA, spanning from the leader sequence to the stop codon, from 15 DQA1 alleles and 15 DQB1 alleles. We identified several new DQ alleles which had identical exon 2 sequence and were different in other exons. On the basis of the sequence analyses, a comprehensive PCR-based oligotyping system for DQA1 gene was established. We then characterized DRB1-QAP(DQA1 promoter)-DQA1-DQB1 haplotypes of B-lymphoblastoid cell lines homozygous for HLA and healthy unrelated Japanese and Norwegian populations. It was revealed that DQA1 alleles, which were identical in exon 2 but different in other exons, showed close linkage disequilibrium with diferent characteristic DRB1, QAP and DQB1 alleles. These results suggest that DR-DQ haplotypes have been generated in the early stage of molecular evolution.     

The Rad9-Hus1-Rad1 (9-1-1) clamp activates checkpoint signaling via TopBP1

DNA replication stress triggers the activation of Checkpoint Kinase 1 (Chk1) in a pathway that requires the independent chromatin loading of the ATRIP-ATR (ATR-interacting protein/ATM [ataxia-telangiectasia mutated]-Rad3-related kinase) complex and the Rad9-Hus1-Rad1 (9-1-1) clamp. We show that Rad9's role in Chk1 activation is to bind TopBP1, which stimulates ATR-mediated Chk1 phosphorylation via TopBP1's activation domain (AD), a domain that binds and activates ATR. Notably, fusion of the AD to proliferating cell nuclear antigen (PCNA) or histone H2B bypasses the requirement for the 9-1-1 clamp, indicating that the 9-1-1 clamp's primary role in activating Chk1 is to localize the AD to a stalled replication fork.     

先兆子痫患者HLA-DQA1、-DQB1、-DPA1基因多态性

目的:探讨人类白细胞抗原HLA-DQ-A1、DQB1、DPA1基因多态性与先兆子痫发病的关系。方法:采用序列特异性引物技术(PCRSSP)对46例先兆子痫患者和105例正常孕妇及其新生儿进行HLA-DQ-DPA1等位基因分型。结果:所有标本共检出11种HLADQA1基因表型、16种HLADQB1基因表型、6种HLADPA1基因表型。先兆子痫患者HLA-DQ-B10301基因频率高于正常孕妇,差异有显著性(Pc=0.032,RR=2.43,AR=0.30),其余各基因表型频率两组比较差异均无显著性。结论:HLADQB10301基因可能是一种先兆子痫发病的易感基因。