小鼠新基因 msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征

目的：研究小鼠系统性RNAi相关基因msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征。方法：通过生物信息学方法寻找小鼠中与线虫的sid-1基因同源的基因，用RT-PCR方法从小鼠大脑中分离到其全长cDNA；将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1，用脂质体介导转入CHO细胞，确定其亚细胞定位。结果与结论：基因msid2的cDNA全长1353bp，编码450个氨基酸，定位于小鼠16号染色体，其基因组全长16kb，包括14个外显子和13个内含子。亚细胞定位试验结果初步表明，该蛋白定位于内质网及质膜。RT-PCR结果显示msid2在小鼠大脑、小脑中高表达，而在其他组织表达水平较低。     

人类新基因flj20174的克隆、亚细胞定位、表达谱及功能初探

目的：研究人类系统性RNAi相关基因flj20174的克隆表达、亚细胞定位和表达谱，以及功能的初步探索。方法：利用生物信息学方法分析、预测flj20174基因的表达谱和功能；采用RT-PCR技术，从健康人外周血单个核细胞cDNA中，扩增获得flj20174可能的全长编码区，并将其亚克隆于pEGFP-N1载体；利用Northern杂交鉴定其转录本；利用半定量PCR确定flj20174在免疫组织和免疫细胞中的表达谱；通过脂质体转染入HeLa细胞，观察融合蛋白的亚细胞定位和过表达对细胞状态的影响。结果与结论：获得了2484bp的全长编码区。测序后发现与NCBI公布的Ak00018的序列完全一致；Northern杂交证实其转录本约为4669bp；证实该基因属于低丰度基因，在免疫细胞中有相对较高的表达，并在B细胞和T细胞激活后表达量下降；与EGFP融合表达后可见该蛋白主要分布于内膜系统，而且过表达该融合蛋白可以引起细胞的死亡，推测此过程可能与机体的免疫防御相关。     

TRIM基因家族一个新成员的克隆及功能研究

目的:克隆小鼠早期胚胎发育相关的新基因uTRIM,研究其胞内亚定位及功能.方法:通过数字差异显示搜索到可能和小鼠早期胚胎发育相关的新基因uTRIM,用RT-PCR方法从体外培养的小鼠囊胚中分离得到其全长cDNA;将其克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1中,在HEK 293细胞内表达后确定uTRIM分子的亚细胞定位.用RNAi对其在胚胎发育早期的功能进行初步的研究.结果与结论:uTRIM基因只在胚胎发育早期和成体睾丸组织中表达,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中.RNAi结果显示抑制uTRIM表达使小鼠受精卵体外发育速度加快,提示uTRIM参与早期胚胎发育的负调控.     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

内皮活化相关新基因EOLA1的亚细胞定位及组织表达

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因的亚细胞定位和组织表达特性,为对其进行进一步的功能研究打下基础。方法构建EOLA1-EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达质粒,转染内皮细胞后瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位;通过人多组织Northern杂交研究EOLA1基因的组织表达。结果EOLA1蛋白在正常人各组织中呈选择性表达,在人的心脏、骨骼肌、肾脏、肝脏和胎盘组织中有较强的表达,在结肠、脾脏和小肠中有较弱的表达,而在脑、胸腺、肺和外周白细胞中无表达;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆,少量表达于细胞核。结论EOLA1属胞内蛋白,可能在细胞内信号转导中起着作用。     

新基因TIG-310的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21a免疫中的表达变化研究

目的：研究Ty21α免疫相关新基因(Ty21α immunization—associated gene，TIG—310)的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21α免疫中的变化规律。方法：采用PCR技术，扩增TIG—310可能的编码区，将其克隆至pQE30载体，在M15菌株中进行诱导表达；采用原位杂交技术对TIG—310基因的表达产物在肠黏膜组织进行细胞定位；将其亚克隆至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—N1，通过电击传染导入L细胞，确定其亚细胞定位；通过RT—PCR研究其在Ty21α免疫中的变化规律。结果与结论：TIG—310的编码区在原核表达系统中获得包涵体表达；原位杂交结果显示该基因表达在肠黎膜的上皮细胞中；与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果表明，该蛋白定位于整个细胞内。该基因在正常的BALB／c小鼠的胃肠黏膜高表达，在Ty21α第一次灌胃免疫后表达量显著增高，随着免疫次数的增加，TIG—310的表达量逐渐恢复正常。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法 抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库。BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90．4％、21．6％和19．7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％：R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90．7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。     

小鼠脑损伤相关基因的克隆及表达与生物学功能初步分析

目的 克隆1个与小鼠脑损伤早期反应相关的新基因(GBI),并对其功能进行初步分析.方法 SMART-RACE技术克隆该新基因全长cDNA;采用生物信息学软件分析其可能的功能结构域和进行序列相似性分析;Northern Blotting分析该基因在小鼠主要组织器官的生理水平的表达.结果 该新基因全长cDNA序列为1798bp,含1个编码249个氨基酸残基蛋白质的开放性阅读框.推导蛋白质分子与1个即刻早期蛋白IE175和1个应激相关蛋白RAB21具有部分序列相似性.Northern杂交显示其仅仅在小鼠脑组织有基础水平的表达.结论 该基因可能与创伤早期反应的应激信号转导相关,并命名为脑损伤相关基因GBI(gene related to brain injury,gi|19338981|gb|AF481964.1).     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

人脂多糖应答新分子在正常胎儿组织中的分布

目的：研究人脂多糖应答基因（Lrg）这一新分子在正常胎儿组织中的表达分布情况。方法：利用课题组制备的兔抗人Lrg免疫血清，对胎儿心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、睾丸和皮肤等进行免疫组化染色；特异性标记lrg目的基因，用Digoxin标记检测试剂盒，对胎儿小肠及睾丸组织进行原位杂交检测。结果：免疫组化实验表明Lrg在几种检测组织内均有表达，表达水平由强到弱依次为胃、睾丸、食管、小肠、肝、肾、心、肺等；原位杂交方法检测表明人lrg-mRNA在睾丸及小肠组织内高表达。结论：人Lrg在正常胎儿组织中有表达，但分布情况有差异，可能是一种新型功能蛋白。     

IL—6相关基因的克隆与鉴定

目的：克隆和鉴定IL－6作用相关基因将有助于揭示IL－6信号转导机制和发现新的信号分子,方法：以来源于IL－6处理和未处理的U937细胞mRNA的双链cDNA作为检测子和驱动子,进行cDNA代表性异分析,结果：分离了14个差异表达基因序列（EST）,反向RNA Nortghern杂交筛选到9个差异表达序列,经测序及序列分析,其中7个差异表达的EST代表在细胞生命活动或信号转导中有重要的作用的已知基因,2个EST代表与IL－6作用相关的新基因,Northern印迹和时间表达普进一步证明了P52和P31代表的新基因与IL－6作用的相关性,结论：上述结果提示这些差异cDNA序列可能与IL－6信号转号作用密切相关。     

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，制备电泳纯化出高纯度的重组蛋白     

应用mRNA差异显示法初步研究肺癌相关基因

目的：研究高氡暴露地区居民肺癌组织中相关未知基因，探讨肺癌发生的机理。方法：应用mRNA差异显示方法从同一例肺癌和正常肺组织中选出有表达差异的基因片段，经反向Northern Blot杂交，将肺癌组织表达呈阳性的片段而正常肺组织呈阴性的片段进行克隆测序。结果：7条差异片段经克隆测序后发现，其中NA7与Genbank EST中的A1208667序列同源性达95％以上，NG2与5条基因序列同源性高达98％，而CA1可能是一个新的差异基因片段，结论：从高氡暴露地区居民肺癌和正常组织中获得3条可能与肿瘤相关的基因片段。     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

人肾尿酸转运蛋白1基因克隆、抗体制备及其在肾小管上皮细胞中的定位

目的 制备人尿酸转运蛋白1(hURAT1)多克隆抗体并利用该抗体检测hURAT1在肾组织中的表达及亚细胞定位。方法 用RT-PCR方法从人肾组织中扩增出hURAT1基因全长及其抗原表位区，分别构建绿色荧光蛋白hURAT1-pEGFP融合表达载体和GST融合表达载体pGEX-5X-1。诱导表达并纯化GST融合蛋白，利用改良的蛋白免疫法制备多克隆抗体；Western blot及免疫组化方法观察人肾组织的hUART1基因产物的表达。将hUPAT1-pEGFP重组质粒转染细胞，激光共聚焦显微镜动态观察hURAT1-pEGFP在肾小管上皮细胞LLC-PK1细胞膜的定位及表达。结果 成功获得高效特异的hURAT1抗体，利用该抗体证实hURAT1基因编码产物分布于人肾组织近端肾小管刷状缘，Western blot证实hURAIT1蛋白在肾组织中表达。激光共聚焦显微镜动态观察显示hURAT1-pEGFP定位于LLC-PK1细胞膜。结论 制备的hURAT1抗体及其全长基因可用于hURAT1基因的生理功能及病理研究，hUPAT1基因编码产物分布于人肾组织近端肾小管刷状缘。     

Delayed expression of hpS2 and prolonged expression of CIP1/WAF1/SDI1 in human tumour cells irradiated with X-rays, fission neutrons or 1 GeV/nucleon Fe ions.

PURPOSE: Differences in gene expression underlie the phenotypic differences between irradiated and unirradiated cells. The goal was to identify late-transcribed genes following irradiations differing in quality, and to determine the RBE of 1 GeV/n Fe ions. MATERIALS AND METHODS: Clonogenic assay was used to determine the RBE of Fe ions. Differential hybridization to cDNA target clones was used to detect differences in expression of corresponding genes in mRNA samples isolated from MCF7 cells irradiated with iso-survival doses of Fe ions (0 or 2.5 Gy) or fission neutrons (0 or 1.2 Gy) 7 days earlier. Northern analysis was used to confirm differential expression of cDNA-specific mRNA and to examine expression kinetics up to 2 weeks after irradiation. RESULTS: Fe ion RBE values were between 2.2 and 2.6 in the lines examined. Two of 17 differentially expressed cDNA clones were characterized. hpS2 mRNA was elevated from 1 to 14 days after irradiation, whereas CIP1/WAF1/SDI1 remained elevated from 3 h to 14 days after irradiation. Induction of hpS2 mRNA by irradiation was independent of p53, whereas induction of CIP1/WAF1/SDI1 was observed only in wild-type p53 lines. CONCLUSIONS: A set of coordinately regulated genes, some of which are independent of p53, is associated with change in gene expression during the first 2 weeks post-irradiation.