siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

miRNA-192对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨抑制microRNA-192（miR-192）在非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测人肺腺癌耐DDP细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549细胞中miR-192的表达水平,A549／DDP细胞转染miR-192抑制剂（inhibitor）和miR-阴性对照（NC）48h后采用qRT-PCR检测转染效率,分别采用MTT法、克隆形成实验及流式细胞术检测转染48h后A549／DDP细胞对DDP的药物敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,Western blotting检测转染48h后细胞中Bax和Bcl-2的表达变化。结果 miR-192在A549／DDP细胞中的表达水平高于A549细胞（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor 48h后的A549／DDP细胞miR-192水平低于转染miR-NC者（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor后,A549／DDP细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多、DDP对其半数抑制浓度降低、Bax蛋白水平升高和Bcl-2蛋白水平下降,与转染miR-NC者比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 抑制miR-192能够降低A549／DDP细胞对DDP的耐药性,其作用机制可能是通过增加细胞凋亡以及下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白表达来实现的。     

MINDY2过表达慢病毒质粒的构建及其对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的:构建能表达MINDY2的慢病毒质粒,并获取稳定过表达MINDY2的A549细胞株,探讨过表达MINDY2对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法:采用同源重组法构建pLVX-Flag-MINDY2过表达质粒,并通过菌落PCR和测序对重组质粒进行鉴定;在HEK293T细胞中瞬时转染pLVX-Flag-MINDY2质粒,通过Western blot实验检测Flag-MINDY2融合蛋白的表达;重组慢病毒载体包装HEK293T细胞,获取病毒上清液感染A549细胞,嘌呤霉素筛选后利用Western blot实验检测Flag-MINDY2融合蛋白的表达;CCK8实验、Transwell和划痕实验检测过表达MINDY2对A549细胞增殖和迁移能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡及周期变化。结果:测序结果证明成功构建了MINDY2过表达慢病毒载体;在HEK293T细胞中瞬时转染MINDY2重组质粒,能检测到Flag-MINDY2融合蛋白的表达;Western blot结果显示MINDY2在A549细胞中稳定过表达;CCK8实验表明过表达MINDY2能够抑制A549细胞的增殖;流式细胞术表明...     

转染BAX基因对A549细胞系的凋亡及化疗敏感度的影响

目的 探讨BAX转染是否增强人肺癌A549细胞对顺铂致凋亡的敏感度。方法 通过CCK8法检测顺铂对A549细胞体外增殖的影响。应用脂质体介导重组真核表达载体BAX-pcDNA3.1和空载体pcDNA3.1质粒转染至人肺癌A549细胞中,G418筛选阳性细胞。RT-PCR法检测BAX在A549细胞中的表达。将不同浓度的顺铂分别作用于A549、A549/BAX和A549/pcDNA3.1细胞72 h,CCK8法测定各组细胞的存活率,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果 顺铂能抑制A549细胞体外生长,BAX和顺铂使A549细胞发生G₁/S期细胞阻滞。RT-PCR显示转染BAX基因的A549细胞中BAX表达显著增加,转染BAX基因及加药组细胞凋亡率明显增加。 结论 稳定转染BAX基因明显增强A549细胞对顺铂致凋亡作用的敏感度。     

shRNA下调BAG-1表达降低肺癌A549细胞对顺铂的耐药性

目的：通过载体介导的shRNA下调BAG-1基因（Bcl-2 associated athanogene-1)表达,探讨其对肺癌A549细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药性的影响。方法：构建靶向BAG-1的shRNA干扰载体pGCsi-BAG-1,稳定转染A549细胞。实验组使用稳定转染pGCsi-BAG-1的细胞株（BAG-1-shRNA）,阴性对照组使用无关序列质粒转染的细胞株（SC-shRNA）,对照组使用未转染的亲本A549细胞株（Control）。Western blotting检测pGCsi-BAG-1转染对A549细胞BAG-1、Bcl-2表达的影响。MTT法、流式细胞术分别检测pGCsi-BAG-1转染对DDP处理后A549细胞的增殖和凋亡的影响。结果：成功构建稳定干扰BAG-1表达的A549细胞株,BAG-1-shRNA组细胞中BAG-1和Bcl-2蛋白表达显著低于SC-shRNA组和对照组（均P<0.05）。随DDP(25~40 μg/ml)浓度增加,各组细胞增殖抑制率也随之升高,DDP浓度为2.5 μg/ml时,BAG-1-shRNA组A549细胞的增殖抑制率即显著高于SC-shRNA组和对照组\[（22.26±4.89）% vs （10.07±3.82）%,（8.12±4.09）%,均P<0.05\]。与SC-shRNA组和对照组相比,DDP(2.5 μg/ml)处理24 h后,BAG-1-shRNA组凋亡率显著升高\[（37.8 4±3.62）％ vs （16.80±281）％、（17.10±3.11）％,P<0.05\]。结论：下调BAG-1表达可抑制DDP作用下的A549细胞的增殖并促进其凋亡。     

构建COX2基因慢病毒载体对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响#br#

目的 构建环氧化酶2（COX2）基因慢病毒表达载体并观察其对非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响。方法 针对COX2基因的不同片段设计3对shRNA的寡核苷酸片段并克隆至慢病毒载体GV248中,构建并筛选最佳抑制效率的靶向COX2基因的慢病毒载体COX2 shRNA。选取对数生长期A549细胞进行慢病毒转染,其中靶向COX2基因的shRNA载体转染A549细胞为shRNA组,以空载体质粒转染作为阴性对照组（NC）及不转染质粒的A549细胞为空白对照组（CON）,采用实时荧光定量PCR和Western blotting测定COX2基因和蛋白的表达。分别采用MTT法和流式细胞仪检测干扰COX2表达对A549细胞增殖、凋亡能力的影响。结果 成功构建靶向COX2基因的慢病毒载体;稳定转染A549细胞后,COX2基因表达下降,其中以COX2 shRNA1干扰效率最为显著;shRNA组中shRNA1转染的A549细胞COX2 mRNA水平为0.17±0.06,低于NC组的081±011和CON组的109±0.07,差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA组细胞增殖活性低于NC组和CON组,shRNA组转染5 d的吸光值为0.976±0.016,低于NC组的1.557±0.015和CON组的1880±0034,差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA组细胞凋亡率为（6.28±0.31）％,高于NC组的（3.08±0.05）％和CON组的（3.01±0.31）％,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建靶向COX2基因的慢病毒表达载体,干扰COX2表达可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖并促进细胞凋亡。     

基于caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路探究SMAC基因对肺腺癌细胞紫杉醇敏感度及细胞活性的影响

目的 基于caspase-3/Bcl2/Bax信号通路探究SMAC基因对肺腺癌细胞紫杉醇敏感度及细胞活性的影响。方法 建立肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol，将细胞分为pcDNANC组（转染pcDNA-NC空白载体）、pc DNA-SMAC组（转染pc DNA-SMAC载体）、siRNA-NC组（转染siRNANC空病毒载体）和siRNA-SMAC组（转染siRNA-SMAC慢病毒载体）。qRT-PCR法检测细胞中SMACmRNA表达；MTT法检测细胞敏感度；克隆实验法检测细胞增殖能力；Transwell法检测细胞侵袭能力；流式细胞术检测细胞凋亡能力；Western blot法检测细胞中caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果 肺腺癌A549细胞较BEAS-2B正常细胞中SMAC mRNA表达明显降低（P<0.05）。pcDNA-SMAC组较pcDNA-NC组细胞中SMAC mRNA表达显著升高（P<0.05）。和siRNA-NC组相比，siRNA-SMAC组细胞中SMAC mRNA表达显著降低（P<0.05）。和pcDNA-NC组相比，pcDNA...     

上调miRNA-506对肺癌耐药细胞株A549/DDP耐药性的逆转及其机制

目的:探讨微小核糖核酸（miRNA）-506对人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞耐药性的逆转及其可能机制。方法:构建miRNA-506 模拟物,应用脂质体法转染A549/DDP细胞。应用实时逆转录酶链聚合反应（qRT-PCR）法验证各组细胞中miRNA-506的表达情况,CCK8法检测顺铂对细胞的抑制作用。流式细胞术Annexin V／PI双染检测各组细胞的凋亡。Western blot检测MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果:qRT-PCR结果显示,miRNA-506转染组miRNA-506的表达量明显高于对照组（P<0.05）。CCK8结果显示,上调miRNA-506 增强A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。流式细胞术结果显示上调miRNA-506 促进顺铂诱导的A549/DDP细胞凋亡。上调miRNA-506可以使A549/DDP细胞MDR1、MRP1和Bcl-2蛋白的表达下降,使Bax蛋白的表达升高。结论:上调miRNA-506能逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药,这一过程可能通过miRNA-506调控多药耐药蛋白和凋亡相关蛋白实现。     

Sox2对膀胱癌细胞化疗耐药的影响及其分子机制的探讨

摘 要：［目的］ 探讨Sox2对膀胱癌细胞化疗耐药的影响及其分子机制。［方法］ 选用T24人膀胱癌细胞系,采用浓度递增方式建立顺铂耐药细胞系T24/DDP,慢病毒载体转染对应细胞,进行Sox2基因过表达或敲除,得到T24-Sox2细胞和T24/DDP-shSox2细胞系。qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中Sox2与多药耐药相关蛋白（MRP）表达水平。MTT实验检测各组细胞在不同浓度顺铂作用下的吸光度值并计算IC50,绘制耐药曲线。流式细胞术检测各组细胞凋亡率,并使用qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。［结果］ qRT-PCR和Western blot结果证实Sox2和MRP在膀胱癌顺铂耐药细胞系中高表达,耐药曲线提示Sox2与膀胱癌的顺铂耐药存在一定关联,耐药细胞系的IC50为(15.24±1.12)μg/ml,而非耐药细胞系的IC50为(4.88±0.72) μg/ml,P<0.05。Sox2表达上调能够抑制膀胱癌细胞凋亡,凋亡率从74.62%下降到25.84%,P<0.05。Bax和Caspase-3在Sox2高表达的细胞中呈低表达,而Bcl-2则呈高表达。［结论］ Sox2基因在顺铂耐药膀胱癌细胞系中表达水平显著高于正常非耐药膀胱癌细胞,且Sox2可能是通过抑制细胞凋亡来实现对化疗敏感性的调控。     

miRNA-139-5p通过靶向调控CXCR4/CXCL12信号通路逆转非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药

目的:探讨miRNA-139-5p对非小细胞肺癌A549细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药的影响,及其可能的分子机制。方法:采用DDP浓度递增法诱导A549细胞建立DDP耐药细胞株A549/DDP,将miR-139-5p mimics、无义序列（mimics-NC）、CXCR4过表达质粒（pcDNA3.1-CXCR4）、pcDNA3.1空载质粒（Vector）转染至A549/DDP细胞中,将细胞分为mimics-NC组（转染无义序列）、mimics组（转染miR-139-5p mimics）、mimics+Vector组（共转染miR-139-5p mimics和空载质粒）和mimics+CXCR4组（共转染miR-139-5p mimics和CXCR4过表达质粒）,另设置空白对照组（blank）。不同浓度DDP处理,MTT法检测细胞增殖活性,并计算IC50值和耐药指数（resistance index,RI）;qRT-PCR法检测细胞中miR-139-5p和CXCR4 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及CXCR4/CXCL12信号通路相关蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p与CXCR4的靶向关系。结果:不同浓度DDP处理24 h后,耐药株A549/DDP及其亲本A549细胞IC50值分别为（208.87±27.89）μmol/L和（31.66±6.30）μmol/L,RI=6.59。与亲本A549细胞比较,耐药株A549/DDP中miR-139-5p的表达水平明显降低（P＜0.05）,而CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与mimics-NC组比较,mimics组A549/DDP细胞增殖活性明显降低（P＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,细胞中CXCR4 mRNA和蛋白以及P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT/AKT等蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与mimics+Vector组比较,mimics+CXCR4组A549/DDP细胞增殖活性显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,而细胞中CXCR4、P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT等蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-139-5p靶向负调控CXCR4表达。结论:miRNA-139-5p通过靶向下调CXCR4表达,提高非小细胞肺癌DDP耐药细胞株A549/DDP对DDP的药物敏感性。