大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

SD大鼠骨髓基质干细胞的全骨髓培养与鉴定

目的：采用体外全骨髓培养法培养SD大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）并进行鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、CD34、CD45的表达。结果：全骨髓培养法能迅速、有效地培养和获得大量骨髓基质干细胞,流式细胞仪检测显示CD29阳性率为99.0%,CD34阳性率1.5%,CD45阳性率0.8%。结论 ：全骨髓贴壁培养法是获得骨髓基质干细简捷、高效、经济的途径,可以获得较纯的BMSCs。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较及细胞鉴定

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）不同培养方法的差异。方法采用全骨髓法和密度梯度离心法,对 SD大鼠股骨、胫骨骨髓进行分离、纯化和扩增,观察2种方法培养的第0～10代的细胞形态,测定每一代细胞的数量,用流式细胞仪检测第5代细胞 CD29、CD34、CD44、CD45的表达率。结果2种培养方法所获得的细胞形态均呈长梭形,呈特征性的漩涡状生长。全骨髓培养法细胞增殖较快。全骨髓培养法获得的细胞表面标志 CD29、CD34、CD44、CD45的表达率分别为91．0％、4．3％、87．1％、0．1％;密度梯度离心法获得的细胞表面标志 CD29、CD34、CD44、CD45的表达率分别为96．9％、3．6％、89．7％、0．0％。结论2种方法培养的细胞均符合BMSCs的特性。全骨髓培养法更经济,操作简单易行,更容易获得大量的BMSCs。     

两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析

目的比较分析目前较简单易行的贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的效果.方法用贴壁培养法和密度梯度离心法分别培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测MSCs的表面标记物.结果贴壁培养法培养的原代细胞较密度梯度离心法培养的原代细胞生长快,但传代细胞这一差异不明显;而密度梯度离心法培养的原代细胞较贴壁培养法培养的原代细胞形态一致,随着传代的增加,贴壁培养法培养的细胞形态逐步趋于一致.流式细胞仪检测示：贴壁培养法培养的细胞：CD29（99.8%）、CD90（99.6%）、CD34（3.01%）;密度梯度离心法培养的细胞：CD29（100%）、CD90（97.1%）、CD34（0.89%）.结论用贴壁培养法和密度梯度离心法都可以得到纯度较高的MSCs,两种培养方法的效果无明显差异.     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法采用改良全骨髓贴壁方法,分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29的表达情况。结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁。8～10 d可达80%～90%融合,纯化后传代周期为6～8 d。流式细胞术鉴定表明CD45阴性,CD29阳性。结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物,并进行成脂、成骨分化诱导。结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。生长曲线呈S形,细胞周期显示86.02%P3代细胞为G0/G1期,保持活跃的扩增能力。BMSCs高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。成脂诱导21 d后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。     

膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的研究

目的: 探索大鼠膀胱无细胞基质负载骨髓间充质干细胞体外构建组织工程膀胱复合物的可行性。
方法: 全骨髓贴壁培养法提取大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs) ，物理和酶消化法相结合制备大鼠膀胱无细胞基
质( BAMG) ，将分离纯化的P3 代BMSCs 接种在BAMG 上共同培养构建组织工程膀胱复合物，HE 染色观察复合
物的细胞生长情况，以P3 代BMSCs 的单独培养做对照，绘制两组细胞生长曲线图，对比评价BAMG 对BMSCs
生长有无影响。结果: ( 1) 全骨髓贴壁培养法分离培养的BMSCs 经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44
抗原表达阳性，而CD34 呈阴性表达。( 2) 应用物理法和酶消化法相结合成功制备BAMG，HE 和扫描电镜均未
见细胞残留，具有完整的胶原及纤维结构。( 3) BMSCs 与BAMG 能黏附生长，体外成功构建组织工程膀胱复合
物，其生长曲线和对照组基本相同。结论: 全骨髓贴壁培养法能简单有效的增殖纯化BMSCs，物理法和酶消化法
相结合可以成功制备BAMG，二者体外成功构建组织工程膀胱复合物。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

目的 建立一套简单易行有效的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养、纯化、鉴定的方案,初步了解BMSCs的基本性状和功能特点.方法 取4周龄雄性SD大鼠,全骨髓贴壁培养BMSCs,对细胞相关的性状进行观察及分析,流式鉴定表面抗原,诱导其成骨、成脂分化,并进行染色鉴定等.结果 流式检测结果CD29、CD90呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应,成骨诱导分化后茜素红染色呈阳性反应,成脂诱导分化后油红染色呈阳性反应.结论 全骨髓培养法是一种相对简单易行的BMSCs分离纯化的方法,可获得纯度高,活性好,性状均一的BMSCs.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期.细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/C1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性.结论 体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济.     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外CFSE染色标记的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）体外分离、培养、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光标记的实验方法。方法差速贴壁离心法分离纯化大鼠BMSCs,并进行表面标志物流式检测鉴定和成脂、成骨分化鉴定。 CFSE标记BMSCs ,荧光显微镜下观察BMSCs 形态和标记率,台盼蓝染色检测CFSE对BM-SCs存活率的影响,以筛选CFSE标记BMSCs的最佳条件。结果第5代BMSCs的特异性表面标志物： CD29阳性,阳性率为90．10％;CD90阳性,阳性率为96．61％;CD45阴性,仅0．40％表达。且BMSCs具有成脂和成骨分化能力。10μmol/L CFSE作用15 min时,BMSCs的CFSE标记率几乎达到100％,且对BMSCs 的活性没有影响（P＞0．05）。结论利用差速贴壁法可获得纯度高、未分化性能强的BMSCs,BMSCs标记CFSE的最佳条件为10μmol/L CFSE作用15 min。