体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞的实验研究

目的:培养小鼠胰腺导管上皮细胞并使之转分化为胰腺干细胞及胰岛样细胞,为胰岛移植治疗糖尿病提供细胞来源.方法:分离培养昆明小鼠胰腺导管上皮细胞,以添加有角化细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养,分别于光镜和电镜下观察细胞形态和超微结构的变化.采用细胞免疫化学染色检测第1天和16天时CK-19、PDX-1蛋白的表达,RT-PCR检测第1天和16天时胰岛素和胰高血糖素基因的表达,第21天行双硫腙染色试验及葡萄糖刺激的胰岛素释放试验.结果:培养第7～10 d,细胞快速增殖成鹅卵石样;培养第16～21 d,细胞逐渐聚集,最终形成胰岛样细胞团;培养第16 d,细胞超微结构的变化表明上皮细胞在向干细胞转分化.免疫化学染色显示,分离第1天,大部分细胞CK-19染色阳性,偶见PDX-1弱阳性细胞,第16天时,CK-19阳性细胞快速增殖形成细胞团,大部分细胞PDX-1染色阳性.RT-PCR显示培养第16天,细胞胰岛素和胰高血糖素表达较培养第1天明显增强(P<0.01).培养第21天,胰岛样细胞团更加成熟,双硫腙着色阳性,且在高糖(15 mmol/L)刺激下的胰岛素释放较低糖(5.6 mmol/L)刺激时增加了1.6倍(P<0.05).结论:小鼠胰腺导管上皮细胞在体外培养条件下可增殖,并具有干细胞潜能,可转分化为胰岛素分泌细胞.     

成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞观察

目的:体外定向诱导成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化.方法:首先将成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、bFGF及EGF等因子的培养基(诱导液1)中诱导6 d,接着更换诱导培养基,用含适当浓度的β细胞调节素、尼克酰胺等高糖无血清培养基(诱导液2)诱导细胞向胰岛样细胞分化,诱导前后用RT-PCR法检测细胞nestin、神经元素3(ngn3)、胰岛素启动因子1(IPF-1)、胰岛素、胰高血糖素基因的表达;免疫组织化学法检测nestin、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素抗原的表达;放射免疫分析法检测细胞胰岛素分泌情况.结果:成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞经诱导液1诱导6 d后可分化成nestin 的祖细胞;继续用诱导液2诱导6 d后变圆的细胞逐渐增多,并聚集成团,免疫荧光结果证实经2阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素,放射免疫分析结果表明诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素.结论:成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞具有胰腺干、祖细胞的固有特征,极有可能作为种子细胞用以糖尿病的细胞治疗.     

成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的初步研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成为胰岛β细胞的可能性。方法采用Percoll分离液和差异贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞，在纤维连接蛋白包被。含有表皮生长因子和血小板源性生长因子BB的低浓度血清（2％FBS）培养液中培养，传代后用碱性成纤维细胞生长因子、B27添加剂、尼克酰胺诱导。放免法检测培养液中胰岛素．双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定。并进行体外细胞功能测定。结果细胞诱导第二周逐渐聚集成胰岛样细胞团．开始分泌胰岛素，双硫腙染色成猩红色，免疫荧光显示细胞表达胰岛素，体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性。结论成人骨髓间充质干细胞可以在体外一定条件下实现向β细胞转分化。     

胰岛新生相关蛋白肽方案诱导人脂肪源性干细胞体外分化成为胰岛样细胞团的效果评价

目的： 探讨胰岛新生相关蛋白(INGAP)联合细胞因子诱导人脂肪源性干细胞(hASCs)分化为胰岛样细胞团的效果。方法：分离、纯化、鉴定人脂肪源性干细胞。应用胰岛新生相关蛋白肽(INGAP-pp)联合细胞因子进行四步法诱导,RT-PCR、实时定量PCR及细胞免疫荧光检测诱导后细胞胰腺发育及功能基因的表达变化,在不同浓度（5.6和25.0 mmol·L^-1）葡萄糖刺激下,检测分化细胞胰岛素及C肽分泌量。结果: 在诱导过程中,干细胞相关基因Oct3/4表达降低至原始水平的1/20,而与胰腺系分化发育相关的基因(Ck19、nestin、pdx-1及nkx2.2均显著升高。在诱导分化后期,INGAP-pp/Scramble-pp 诱导组均出现了胰岛样细胞团,INGAP-pp诱导组细胞团的直径为150～200 μm,而Scramble-pp诱导组细胞团的直径为50～100 μm,前者更接近天然胰岛直径。免疫荧光检测显示,胰岛样细胞团中存在胰岛素和C肽双阳性的细胞群,对不同浓度的葡萄糖刺激有反应,分泌量约占天然胰岛细胞的1/15～1/10。 结论：INGAP-pp诱导方案可诱导hASCs向胰腺系细胞分化,在体外形成具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团。提示hASCs有望替代胚胎干细胞及骨髓来源间充质干细胞,成为细胞移植治疗糖尿病的种子细胞。     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.     

人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗NOD/SCID糖尿病小鼠

目的 探讨人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID）小鼠的可行性.方法 体外分4阶段诱导hESCs定向分化为胰岛细胞：①诱导分化形成定型内胚层;②诱导胰腺细胞定向分化;③扩增胰腺前体细胞;④促进胰岛细胞成熟.观察诱导各阶段细胞形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因（PDX-1）、胰高糖素（glucagon）、胰岛素（insulin）、C肽（C-peptide）、葡萄糖转运子2（Glut-2）的表达.3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入链脲菌素（streptozotocin,STZ）诱导形成的NOD/SCID糖尿病小鼠一侧附睾脂肪垫内,观察血糖变化.结果 hESCs诱导4阶段细胞表达胰高血糖素、胰岛素、Glut-2;共表达PDX-1和C肽;流式鉴定诱导4阶段胰岛素阳性细胞为17.1％;体外检测有葡萄糖刺激的胰岛素释放反应;3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入NOD/SCID 糖尿病小鼠体内可逆转其高血糖至少12周.结论 体外定向诱导hESCs分化形成的胰腺前体细胞及胰岛细胞分别植入NOD/SCID小鼠可逆转其高血糖.     

体外诱导Balb／C小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团的形态观察

目的 体外诱导Balb／C小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞团，观察细胞表面形态学的变化。方法 选用Balb／C小鼠ES细胞．经过拟胚体(EB)发育分化4d后开始定向诱导培养，不同时问段分别向细胞培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和尼克酰胺和N等细胞生长因子，使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团。免疫细胞化学检测表达胰岛素和胰高血糖素的阳性细胞。原子力显微镜(AFM)原位扫描阳性细胞团。结果EB细胞生长为大小不一、境界清楚的细胞团，细胞团内细胞排列紧密。胰岛B细胞数量多，主要分布在细胞团的中央，边缘少，染色较淡。而表达胰高血糖素的A细胞主要分布在细胞团的边缘，数量相对较少。AFM扫描可见表达胰岛素的阳性细胞团，其表面有很多类似神经纤维的纤维束，连接成网络状。在细胞质中，还有很多类圆形的颗粒物质，其大小几乎一致．粒径都处于0．5～1．0μm间。结论 诱导分化得到的细胞团不仅有形态和功能上的成熟，而且还具备良好的组织结构，为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据。     

诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的实验研究

目的探讨人体脂肪间充质干细胞生成胰岛素(insulin)分泌细胞的诱导方法及其对I型糖尿病大鼠的疗效评估。方法在人体腹部收集脂肪组织,通过酶消化法和物理震荡相结合分离脂肪干细胞;通过多种细胞因子的搭配诱导脂肪干细胞生成胰岛素分泌细胞。采用流式细胞仪分析、双硫腙染色鉴定脂肪干细胞和诱生的胰岛素分泌细胞;ELISA法检测诱导后细胞培养液上清中胰岛素分泌水平;通过流式细胞仪检测诱生细胞中胰十二指肠同源框因子-1(PDX1)、Insulin、C肽(C-Peptide)以及葡萄糖转运体-2(Glut-2)等相关基因的表达变化。建立I型糖尿病大鼠模型,随机分为模型对照组和模型实验组,对模型实验组大鼠进行干细胞治疗实验和疗效评估。结果脂肪间充质干细胞表面抗原主要表达CD13(90.4%),CD29(89.3%),CD44(91.9%),CD105(80.1%),而不表达CD34、CD45和HLA-DR。诱导分化后脂肪干细胞形成β细胞小簇,具有胰岛素分泌能力,鉴定显示胰岛素,C肽,Glut-2和PDX-1呈阳性。模型实验组大鼠经胰岛分泌细胞治疗2周后血糖明显降低,差异有统计学意义(P0.05),但两组大鼠体重变化差异无统计学意义(P0.05)。结论成功建立脂肪干细胞体外分离、培养的方法及其诱导向胰岛素分泌细胞定向分化的方法,为日后开展临床糖尿病的自体细胞移植治疗提供可靠的新的细胞来源和有效的细胞治疗方法。     

人脂肪间充质干细胞体外诱导为肝脏样细胞的试验研究

目的 探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法.方法 采用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs),原代培养并采用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原白细胞分化抗原13(Cluster differentiation13,CD13)、CD73、CD34、CD45和人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的表达,采用诱导培养基将hADSCs向成脂及成骨方向诱导.采用两阶段细胞因子诱导法诱导hADSCs,并观察其形态变化;采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法及细胞免疫组化法检测肝细胞相关基因甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18抗体(cytokeratin18,CK18)、细胞角蛋白19抗体(cytokeratin19,CK19)等在肝脏样细胞中的表达;采用糖元染色法(Periodic acid-Schiff stain,PAS)检测肝脏样细胞糖原合成情况.结果 用消化离心法获取的hADSCs大小均匀,呈梭形的成纤维细胞样,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测显示hADSCs高表达CD13、CD73,低表达CD34、CD45及HLA-DR;hADSCs体外可被诱导成脂肪细胞及成骨细胞.hADSCs经成肝诱导后,细胞形态由梭形变为多角形的肝脏样细胞,这些肝脏样细胞高表达血清白蛋白(serum albumin,ALB)、AFP、CY3P4等基因,并表达肝细胞相关性蛋白HepPa r-1、AFP、CK18、CK19.PAS染色显示肝脏样细胞胞质呈红色表现.结论 利用消化离心法在体外成功构建了人原代脂肪干细胞系,可长期存活,反复传代,经诱导后可转化为有功能的肝脏样细胞,为脂肪间充质干细胞作为生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据.     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素生成细胞团

目的探讨体外联合应用激活素A、全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺4种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导分化为胰岛素生成细胞团。方法先后以激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子诱导小鼠ESC 14 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫荧光检测分化细胞胰岛素表达。结果分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和免疫荧光染色阳性。结论体外联合应用激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子能够将小鼠ESC诱导分化为胰岛素生成细胞团。     

人脂肪干细胞向脂肪细胞的定向分化

目的：分离和培养人脂肪干细胞（hADSCs）,并在体外定向诱导hADSCs分化为脂肪细胞。方法：利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及胰岛素定向诱导hADSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,hADSCs具有相对特异的细胞表面标志,即CD29、CD73、CD105及CD166呈阳性表达,而CD31及HLA-DR呈阴性表达;hADSCs具有典型的干细胞增殖特点,大部分处于静息期,只有少数细胞处于增殖活跃期;hADSCs能被诱导分化为脂肪细胞。结论：成功地分离、培养出高度同源性的、未分化的hADSCs;体外定向诱导hADSCs可分化为脂肪细胞。     

多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。