不同保护剂对血管性血友病因子制品冻干、干热灭活活性的影响

目的筛选适合血管性血友病因子冻干和100℃干热灭活过程的保护剂。方法将同一批次的半成品分别加入L-脯氨酸、精氨酸、甘露醇和蔗糖,每种配方分3个浓度:1%、2%、3%,然后冻干,干热(100℃,30min),测定干热灭活后血管性血友病因子的活性。结果采用2%精氨酸作为保护剂的制品活性最高,平均(95.0±1.2)IU/m L,活性保留率可达95.2%;L-脯氨酸对血管性血友病因子活性具有一定的保护作用,而甘露醇和蔗糖对血管性血友病因子的活性保留率与空白对照组比较,t分别为3.373,2.212,P0.05。结论 2%精氨酸是血管性血友病因子100℃干热灭活的理想保护剂。     

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。     

MBF21型血浆速冻机对冷沉淀质量的影响

目的探讨原料血浆及冷沉淀冻结时间的长短对制品质量的影响。方法采用血浆速冻机速冻原料血浆和传统低温冰箱直接冻存原料血浆,分别制备冷沉淀,且沿用上述两种方法冻存冷沉淀制品。冷沉淀解冻复融后,检测其中的凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纤维蛋白原(Fbg)含量,对50袋冷沉淀制品的FⅧ、Fbg含量和纤维蛋白絮状物析出的状况进行统计分析。结果应用速冻机速冻原料血浆和冷沉淀制品与应用传统低温冰箱直接冻存原料血浆和冷沉淀制品比较,两者的FⅧ含量、纤维蛋白絮状物的析出,差异有统计学意义(P0.01)。结论实验证明应用速冻机速冻原料血浆和冷沉淀制品,其FⅧ的含量明显高于应用传统低温冰箱直接冻存原料血浆和冷沉淀制品,冷沉淀复融发生纤维蛋白絮状物析出明显减少。速冻的温度和时间是影响FⅧ凝血因子活性及冷沉淀质量的主要因素。     

凝血因子Ⅷ复合物的纯化

本文介绍一种制备高纯度凝血因子Ⅷ(FⅧ)复合物的方法。用新鲜冰冻血浆作为原始材料,收集冷沉淀,溶解后经氢氧化铝[Al(OH)_3]凝胶吸附、甘氨酸沉淀和氯化钠沉淀,得高纯 FⅧ。然后经 Sephacryl S-1000柱层析,收集富含 FⅧ促凝活性(FⅧ∶C)及 von Willebrand 因子(vWF)组分,得到进一步纯化的产品。层析后产品总蛋白含量为0.188mg/ml,FⅧ∶C 为15.43IU/ml,FⅧ相关抗原(FⅧR∶Ag)为9.85U/ml,vWF 的 Ristocetin 辅因子活性(FⅧR∶RCof)为24.2U/ml。火箭电泳测定未显示含有纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)、纤维结合蛋白(Fibronectin,Fn)和IgG 等杂蛋白。     

大量制备高纯的溶剂——去污剂处理的因子Ⅷ浓制剂

作者对新近报告的甘氨酸沉淀法生产因子Ⅷ(FⅧ)做了如下改进:将Al(OH)_3吸附和甘氨酸沉淀结合成一步,以离心代替玻璃珠过滤和用有机溶剂(TNBP)和去污荆(吐温80,T80)灭活病毒。改进后的大规模生产中FⅧ活性收率好(230IU/升血浆)、纯度高(4IU/mg蛋白)。经病毒灭活和冻干的成品FⅧ活性收率185IU/升血浆。其制备要点如下: 1.FⅧ:C分离新鲜冰冻血浆经连续融化法解冻。连续离心(控制上清0～+2℃)得冷沉淀。按30ml/升原血浆加Tris缓冲液[0.02M Tris-(羟甲基)氨基甲烷,盐酸调pH7.0]于28～30℃溶解冷沉淀,加甘氨酸缓冲液(2.8M甘氨酸含0.3M NaCl和0.025M Tris,盐酸调pH6.8)至约2.0M甘氨酸,并     

在因子Ⅷ浓缩制剂生产过程中用巴斯德灭活甲型肝炎病毒及细小核糖核酸病毒的消除

作者报道的因子Ⅷ(FⅧ)浓缩制剂生产过程经(?)6步:冷沉淀→Al(OH)_3吸附→NaCl沉淀→巴斯德法灭活→NaCl/甘氨酸沉淀→冻干。其中第4步所用稳定剂(pH7.3)每毫升含白蛋白20mg、蔗糖588mg,甘氨酸88mg。 为了进行病毒灭活和消除的研究,作者用两种细小核糖核酸病毒:甲型肝炎病毒(HAV)HM175/     

人凝血因子Ⅷ新型离子交换树脂的筛选及吸附性能的研究

目的筛选对人凝血因子Ⅷ吸附效果较好的新型离子交换树脂,研究其吸附性能。方法将初始浓度为(20±1)IU/ml的冷沉淀提取液,恒温摇床振荡吸附2 h,测定吸附后上清液中蛋白浓度及FⅧ活性,通过蛋白吸附量及FⅧ活性吸附率,获得人FⅧ吸附效果较好的树脂;P-15与A-15树脂相同条件下吸附FⅧ,计算FⅧ的活性吸附率以及蛋白吸附量,考察树脂骨架对吸附的影响,同种方法考察树脂孔径大小对吸附的影响;测定吸附过程中吸附液中蛋白浓度的变化,得到吸附动力学曲线,从而确定吸附速率。分别改变A-15树脂用量、吸附温度、冷沉淀粗提液的pH值以及NaCl浓度,计算FⅧ的活性吸附率以及蛋白吸附量,考察树脂用量、温度、pH值、NaCl浓度对吸附的影响。结果 A-15树脂对FⅧ的活性吸附率为(78.76±4.2)%,蛋白吸附量(77.32±3.8)mg/g;A-15树脂未接基团时对FⅧ的活性吸附率为(12.34±5.6)%,蛋白吸附量为(18.68±5.3)mg/g;随着孔径的增大,树脂对FⅧ的活性吸附率和蛋白吸附量均为先增大后减小;树脂为1.25 g时,即可满足对FⅧ的吸附要求;吸附速率常速为0.003 56 g/mg.min;摇床温度为25～30℃、pH值为6.5～7.0、NaCl浓度为(0.1～0.2)mol/L时为较佳吸附条件。结论 A-15树脂对人凝血因子Ⅷ的吸附效果较好,在较佳吸附条件下,树脂对FⅧ的活性吸附率为78±4%,蛋白吸附量为(77±4)mg/g。     

FⅧ成份和HIV感染对HIV抗体阳性血友病病人的免疫学作用

研究对象为46例HIV抗体阳性的重型血友病甲病人,T4+/T8+均低于1.0。病人随机分为4组,每组只接受一种FⅧ制品。第1组用非热处理中纯FⅧ,第2组(11例)用热处理中纯FⅧ。第3组(12组)和第4组(10例)均使用热处理交换FⅧ制品、1、2组FⅧ特异活性分别为0.6和0.9IU/mg蛋白、纤原分别为总蛋白的50%和36%,Fn为1.5%和40%,IgG为10%和6%,IgM为2%和1.3%。3、4组FⅧ的特异活性分别为2和3.6IU/mg蛋白,Fn为2%和17%,IgM为2.4%和3%,3组FⅧ中纤原为80%,IgG为4%,而4组FⅧ中纤原和IgG几乎没有。第2、3组FⅧ分别经60℃72小时和60℃     

人冻干血小板复水程序的优化

目的探讨不同复水条件对冻干血小板功能的影响。方法经过添加激活抑制剂(PGE1、左旋精氨酸、植酸钠和百维利肽)、DMSO和海藻糖等低温保护剂、冷冻干燥后获得冻干血小板,在一系列不同复水程序下对冻干血小板复水,应用流式仪检测并分析其CD62p和PAC-1的表达,评价血小板活化状态。通过正交设计,研究不同复水程序包括复水溶液、复水温度、复水方式3个影响因素对冻干血小板复水后活性的影响。结果 3个对冻干血小板复水后活化的影响因素排序:复水温度>复水方式>复水液(P<0.05);37℃条件下冻干血小板复水后血小板膜蛋白CD62p和PAC-1活化率最低,分别为(5.96±2.51)%和(4.55±1.97)%;预水化后再行四步添加复水可降低冻干血小板膜蛋白CD62p和PAC-1的表达率至(6.68±2.62)%和(5.45±2.06)%;添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和血小板抑制剂的2号复水液对冻干血小板复水后膜蛋白CD62p和PAC-1的表达率影响最低,分别为(6.72±3.35)%和(5.28±2.30)%。总体模型评价进一步显示,第5实验组,即在37℃条件下加入PVP和血小板抑制剂的复水液配方,先预水化后再行四步法添加复水,其复水血小板活化率最低,CD62p和PAC-1的表达率分别为(3.06±1.36)%和(2.70±0.84)%。结论 37℃下,饱和蒸汽环境中预水化后,采用加入PVP及血小板抑制剂的复水液四步添加复水,其复水血小板活化率最低。     

平板血浆速冻机使用效果初步探讨

目的探讨平板血浆速冻机对新鲜冰冻血浆及冷沉淀质量的影响。方法分别采用平板血浆速冻机(实验组)和传统低温冰箱(对照组)冻存新鲜冰冻血浆和相应新鲜血浆制备的冷沉淀。冷沉淀解冻复融后对2组中的凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纤维蛋白原(Fbg)含量和纤维蛋白絮状物析出的状况进行检测和统计分析。结果 2组的FⅧ含量差异有统计学意义(P<0.01),Fbg含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论平板血浆速冻机对缩短新鲜血浆及冷沉淀的冻结时间,减少不稳定凝血因子的损失起到一定的作用。     

人凝血因子Ⅷ抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的双抗体夹心法测定标本中人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ, FⅧ)抗原水平并进行验证和应用。方法建立检测人FⅧ抗原(FⅧ∶Ag)含量的双抗体夹心ELISA法;用人FⅧ/VWF标准血浆(NIBSC 07/316)标定内控标准品(S.A.R.P);根据方法学验证的要求对此方法进行线性、准确度、精密度、样品稳定性的研究分析。将验证后的该方法用于FⅧ纯化工艺的监控及产品质量分析。结果以NIBSC 07/316标定分装冻存的S.A.R.P的FⅧ∶Ag为1.12 Ag/mL,标准曲线的线性范围为(0.003—0.112)Ag/mL,各浓度回收率在97.62%—102.19%,CV<5%,R~2≥0.99;不同浓度样品检测结果的批内准确度在90.70%—95.23%,批间准确度在91.50%—94.20%;批内精密度CV值在1.69%—4.98%,批间精密度CV值在2.63%—4.83%。样品添加实验的回收率在87.50%—89.50%,特异性回收率在94.64%—101.78%。具有生物学活性的样品应-80℃冻存,复融1次后立即检测。武汉血制公司FⅧ纯化工艺中聚乙二醇4000(PEG 4000)沉淀和离子交换层析去除了大约60%的FⅧ抗原,工艺稳定性较好,生产规模可线性放大,不同来源产品FⅧ∶C/FⅧ∶Ag的比值接近。结论本方法具有良好的线性、准确度和精密度。用该方法进行FⅧ抗原含量检测可作为FⅧ纯化工艺内部质量控制的一个指标。     

热处理灭活HTLV-Ⅲ/LAV的因子Ⅷ浓缩物的体内与体外评价

作者评价了一种干热处理(68℃,96小时)因子Ⅷ(FⅧ)浓缩物,灭活HTLV-Ⅲ/LAV的方法,对FⅧ和von Willebrand因子(vWf)的影响。此制品为中纯品,含量约25IU FⅧ:C/ml,比活为0.4IU FⅧ:C/mg蛋白。结果:热处理后,一期法和二期法测定FⅧ:C损失的中位数分别为12.3%,9.8%,非加热处理或热处理制品放置24小时后,FⅧ:C无显著损失。FⅧ:Ag值总是     

抗凝血因子ⅧC2区单克隆抗体的制备及功能研究

目的 制备并鉴定抗凝血因子Ⅷ(FⅧ)c2区单克隆抗体(单抗),研究其对FⅧ活性的影响.方法 体外表达rFⅧ C2区蛋白,免疫BALB/c小鼠制备鼠源性单抗.不同剂量的单抗与正常人新鲜混合血浆孵育后测定FⅧ活性及活化部分凝血活酶时间(APTT)等;ELISA法测定该单抗对rhFⅧ与血管性血友病因子(vWF)、磷脂酰丝氨酸(PS)及血小板结合实验的影响.结果 获得一株抗FⅧC2区单抗,命名为SZ-132.与血浆孵育后呈剂量依赖方式抑制FⅧ活性,APTT明显延长;抗体浓度超过25μg/ml时,FⅧ活性为0;该抗体能够抑制rhFⅧ-vWF、rhFⅧ-PS及rhFⅧ与血小板的结合.结论 SZ-132是一株特异性针对FⅧ C2区的抑制性单抗.     

超多人份混合血浆分馏AHF制备FⅧ:C标准品的可行性研究

目的用超多人份混合血浆分馏抗血友病球蛋白(AHF)制备稳定的用于测定凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)的标准品. 方法以WHO第六代FⅧ∶C标准品(WHO-6)和美国国家FⅧ∶C标准品(MEGA-1)为基准,用一期法测定两个批号工作标准品样品的凝血因子Ⅷ促凝活性,并标定其活性值. 结果用WHO-6标定时两批样品的FⅧ∶C(IU/ml)分别为19.14±2.73 和11.75±2.09 ,用MEGA-1标定时两批样品的FⅧ∶C(IU/ml)分别为18.94±3.00和11.63±1.29.同批样品分别用WHO-6和MEGA-1标定时,其促凝活性值的差异无显著性(P＞0.05).将样品置于-30℃条件下保存6个月,用MEGA-1为基准测定,效价未见明显改变. 结论以已知的国际公认FⅧ∶C质控标准品为基准,用本文所推荐的方法可从超多人份混合血浆分馏的AHF中制备数据可靠、性能稳定的FⅧ∶C检测质控和工作标准品,方法具有一定的可行性和实用性.     

鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉的制备及理化性质考察

目的:制备含有不同冻干保护剂的鬼臼毒素固体脂质纳米粒(POD-SLN)冻干粉,并考察其理化性质,筛选出最佳配方.方法:实验于2006-12/2007-11在南方医科大学药学部实验室完成.冻干配方为15%海藻糖、15%甘露醇和二者联用各取5%,冷冻干燥制作冻干粉制剂.扫描电镜下观察冻干粉复溶后粒子形态,Image-Pro Plus 6.0软件计算粒径大小,高效液相考察固体脂质纳米粒的药物包封率,并考察冻干粉的外观、复溶和4 ℃保存对其影响,评价不同辅料对冻干品的影响.结果:①外观和复溶情况:海藻糖冻干粉、海藻精联用甘露醇冻干粉表面均松脆多孔,疏松,复溶较快,约需20 s,甘露醇冻干粉表面较光滑,结构致密,饼状,复溶较慢,需借助外力.冻干粉样品4 ℃冰箱放置24h、1,3,6个月其外观和复溶均无明显变化.②电镜下粒子形态:呈圆形或椭圆形,分布较均匀,冻干前后无明显差异.③粒径:未加冻干保护剂时为(82.65±18.43) nm,加入海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇后分别为(94.78±21.94), (109.26±16.15),(114.63±21.42) nm.④包封率:未加冻干保护剂时为87.4%,加入海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇后分别为86.2%,80.3%,79.6%.结论:以15%海藻糖为冻干保护剂制备的鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉粒径较小,包封率高,稳定性好,其制备工艺合理可行.     

不同制备方法对新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ活性含量的影响

目的 探讨一次成浆与二次成浆法对制备出来的血浆中凝血因子Ⅷ活性含量的影响.方法 对新鲜采集的全血离心分离血浆并在8 h内冻结成块,然后在37℃水浴中复溶后测定两种方法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量.结果 一次成浆法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量为0.70±0.16 IU/ml,二次成浆法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量为0.84±0.16 IU/ml.结论 两种方法制备的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的含量差异有统计学意义(P＜0.05),二次成浆法比一次成浆法制备出来的新鲜冰冻血浆中凝血因子Ⅷ的活性含量要高,值得推广使用.     

血浆制品凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原水平与献血人群ABO血型关系的研究

目的探讨血浆制品因子Ⅷ(FⅧ)、纤维蛋白原(Fg)含量水平与献血人群ABO血型的关系。方法按照血浆制品类别的不同分为Ⅰ、Ⅱ组,Ⅰ组为冷沉淀组,Ⅱ组为新鲜冷冻血浆(FFP)组;冷沉淀、FFP均为4~6 h采集的400 mL新鲜全血制备而成。分别对上述两组血浆制品进行FⅧ、Fg测定;FⅧ的活性检测采用一期法,Fg采用凝血酶法检测。结果中A、B血型献血者FⅧ、Fg含量较O、AB型者含量显著升高,且A型最高,O型最低,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论由于A、B型人群中的FⅧ、Fg含量较高,可能容易引发对与该种血型相关的疾病;非O血型比较容易患血管栓塞和动脉硬化,可能与该血型人群的FⅧ、Fg含量较高有关。     

基于FⅧ探讨不同脱盐方式的效果及对其成分的影响

目的 基于人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)比较5种脱盐方法的脱盐效果及对FⅧ成分的影响,为蛋白脱盐方式提供参考。方法 分别用Sephadex G-25 Medium凝胶、Fractogel EMD BioSEC凝胶、超滤、室温透析和4℃透析5种方法对人FⅧ进行脱盐处理。通过Na⁺、柠檬酸根离子、甘氨酸去除率评估脱盐效果。通过脱盐前后FⅧ蛋白回收率、FⅧ活性(coagulation factorⅧactivity, FⅧ∶C)、VWF抗原(VWF antigen, VWF∶Ag)、VWF活性(VWF activity, VWF∶Ac)、VWF多聚体及SDS-PAGE分析,评估其对FⅧ成分的影响。结果 在脱盐效果方面：Na⁺在超滤脱盐时去除率最低,为(97.90±0.06)%,Fractogel EMD BioSEC凝胶脱盐去除率最高,为(99.82±0.07)%。除Sephadex G-25 Medium凝胶脱盐与Fractoge EMD BioSEC凝胶脱盐间Na⁺去除率无统计学意...     

冷沉淀制备过程中的关键因素探讨

目的 探讨全血制备冷沉淀过程中,保存温度、制备时间和融化终点对冷沉淀中Ⅷ因子含量的影响.方法 80例全血平均分4组,A组(4±2)℃温度保存6～8 h,B组室温保存6～8 h,C组(4±2)℃温度保存8～10 h,D组室温保存8～10 h,用希森美康CA-50自动血凝测试仪检测每组冷沉淀中Ⅷ因子含量.另外随机选择40例全血制备冷沉淀,(4±2)℃温度保存6～8 h,分为E组(n=20)选择终点为冰块融化至直径4～5 cm、厚度约1 cm,F组(n=20)选择终点为冰块融化至基本无渣,同法检测每组冷沉淀中Ⅷ因子含量.结果 A组冷沉淀中Ⅷ因子含量平均为76.45±15.65 IU,B组为52.55±12.54 IU,C组为58.52±17.84 IU,D组为42.26±10.32 IU,ABCD组采用SPSS11.0统计软件Student-Newman-Keuls方差分析比较,结果表明:A组冷沉淀中Ⅷ因子含量均显著高于其他组的含量(P值均<0.05),D组冷沉淀中Ⅷ因子含量均显著低于其他组的含量(P值均<0.05);E组为75.23±12.65 IU,F组为50.64±12.31 IU,EF组采用SPSS11.0统计软件独立样本t检验(Independent Samples t test)比较,结果表明E组冷沉淀中Ⅷ因子含量显著高于F组(t=2.76,P值<0.05).结论 原料血在(4±2)℃温度保存6～8 h制备冷沉淀,其Ⅷ因子含量最高;终点为冰块融化至直径4~5 cm、厚度约1 cm时制备冷沉淀,冷沉淀中Ⅷ因子含量最高.     

302例血友病甲因子Ⅷ用量的统计分析

血友病甲(Haemophilia A,HA)是常见的出血性疾病之一,患者终生需要补充因子Ⅷ(FⅧ)治疗或预防出血.HA的群体F Ⅷ年用量国外已有报道,平均每例约3万IU,目前国内尚未见有关报道.1996～1998年我们应用血浆冷沉淀治疗HA出血302例,现将其FⅧ输注次数及用量报道如下. 302例HA均按常州会议制定的血友病甲诊断标准确诊,其中重型94例,中型170例,轻型38例,年龄1～55岁,关节肌肉出血192例,牙龈出血40例,尿血29例,消化道出血9例,其他32例. 血浆冷沉淀为FⅧ的来源,按部颁规程由本中心从200ml血浆制得,每袋按含FⅧ80IU计算,-30℃保存备用. 302名HA出血病人均在本中心治疗室接受输注FⅧ治疗.根据治疗记录,统计302例HA的FⅧ输注次数及用量.结果:平均每例每年的FⅧ输注次数为2.5次(1～12次),其中重型HA为3.8次,中型HA为2.2次,轻型为0.6次,每例FⅧ用量为846IU,其中重型HA为1110IU,中型为741IU,轻型为412IU.本文的结果低于国外的报道,分析其原因是多方面的,其中主要与目前我国的经济条件所限有关.