一株能水解巴卡亭ⅢC-10位乙酰基的成团泛菌的筛选和鉴定

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ是合成紫杉醇和多烯紫杉醇的前体。以巴卡亭Ⅲ为底物,结合TLC、HPLC、HPLC-MS分析方法,通过设计专门的筛选方法筛选产酶菌株,得到一株巴卡亭ⅢC-10位脱乙酰基酶产生菌株Z1-56。以形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析作为菌株的鉴定手段,Z1-56被鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans),首次发现成团泛菌产生巴卡亭ⅢC-10-脱乙酰酶。     

巴卡亭Ⅲ转化生成10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ的微生物筛选与鉴定

10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物多烯紫杉醇的前体物质。以巴卡亭Ⅲ为底物,通过TLC、HPLC、LC-MS等方法,对课题组前期从污泥中得到的分离株进行筛选,获得了六株转化巴卡亭III生成10-DAB的菌株,分别命名为P1-A-19、P2-A-8、P2-A-10、P2-A-11、P2-A-12、P2-A-13,通过形态学观察、生理生化试验和16S r DNA序列分析确定其种属信息,P1-A-19被鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica),P2-A-8被鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans),P2-A-11、P2-A-12、P2-A-13均被鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。其中,Raoultella ornithinolytica P1-A-19是首次发现的产10-DAB能力的微生物。     

从南方红豆杉中筛选和鉴定25株产紫杉烷的内生真菌

为从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)中分离产紫杉烷的内生真菌,从其幼茎、树皮和叶片中分离纯化了491株内生真菌,经筛选获得25株内生真菌具有产紫杉烷的能力,其中,4株可产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,8株能产紫杉醇和巴卡亭Ⅲ,1株能产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,1株能产巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,6株仅产紫杉醇,5株仅产巴卡亭Ⅲ。根据内生真菌的来源,幼茎中有11株产紫杉烷的内生真菌,叶片中有9株,而树皮中仅有5株。这些菌株的紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ产量分别为0.64~9.87、0.48~3.42和0.20~1.00μg L~(–1)。因此,南方红豆杉中具有紫杉烷类代谢途径的内生真菌来源广,数量多,是研究真菌中紫杉烷类化合物代谢途径的良好材料,也为紫杉烷类抗癌药生产提供了潜在的真菌种源。     

一株产紫杉醇内生真菌YN6的分离及鉴定

从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）树皮内表皮中分离得到75株内生真菌,采用基于紫杉醇合成关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（10-deacetylbaccatin Ⅲ-10-O-acetyl transferase,DBAT）和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶（C-13-phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase,BAPT）基因为标志分子的快速筛选方法获得一株可产紫杉醇的内生真菌YN6,并通过高效液相色谱法和质谱法对其紫杉醇进行分析.同时,通过对内生真菌YN6的形态特征分析以及18S rDNA序列分析将其初步鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）真菌. 拟盘多毛孢YN6的紫杉醇产量约为120~140 μg/L,是目前已报道的紫杉醇产量较高的野生菌株之一. 拟盘多毛孢YN6的发现为微生物发酵生产紫杉醇提供了潜在的优良种质资源.     

脱氮除磷假单胞菌的筛选及定量检测

【目的】筛选具有较强脱氮除磷能力的细菌,建立结合S1酶保护分析的分子探针技术,以分析该菌在发酵过程中的数量变化情况。【方法】采用缺磷培养基厌氧培养、富磷培养基好氧培养和硝酸盐还原产气实验进行脱氮除磷菌筛选。通过16S rRNA基因序列分析及同源性比对,结合菌株的生理生化鉴定试验,鉴定筛选株。设计相应的16S rRNA探针组,建立结合S1酶保护分析的分子探针技术。【结果】筛选的菌株被鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.,命名为LY10。菌株LY10在富磷培养基中好氧培养24 h,总磷去除率达90.01%。在反硝化聚磷培养基中培养48 h,总氮和总磷去除率分别为84.71%和89.37%。针对假单胞菌16S rRNA基因序列设计了一组用于结合S1酶保护分析的分子探针Probe-P.sp,该探针具有很高的甄别灵敏度,能够将LY10与丛毛单胞属(Commonas)等5种细菌区分开;分子探针定量分析假单胞菌LY10,其细胞量与吸光值呈线性关系,检测的线性范围为103~106 cells/mL,线性方程为:y=-0.967 87+0.372 99x(R2=0.996 7,n=5)。【结论】新筛的假单胞菌LY10的脱氮除磷能力较强,具有生物脱氮除磷的工业化应用潜质。所建立的结合S1酶保护分析的分子探针技术的特异性和灵敏度良好,有望应用于混菌体系中的假单胞菌的定性定量分析。     

利用天蓝色链霉菌转化7-木糖紫杉烷的研究

紫杉醇是目前临床治疗癌症的一线化疗药物,资源紧张,价格昂贵。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)在红豆杉中含量可达紫杉醇的10倍,脱除木糖基后生成的10-脱乙酰紫杉醇(10-DAT)经乙酰化可生成紫杉醇。通过木聚糖平板对不同菌株进行筛选,从52株供试微生物中,发现27株在木聚糖平板上生长良好。经转化实验筛选,发现一株天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor YUCM 410115)具有转化7-XDT为10-脱乙酰紫杉醇的能力。菌体细胞经破碎离心后,沉淀及上清液均无转化反应出现,而发酵液的硫酸铵沉淀物则可以转化7-XDT生成10-DAT,表明该菌株能产生一种胞外紫杉醇-7-木糖苷酶,发酵液酶活为6 268U。首次发现天蓝色链霉菌能够产生紫杉醇-7-木糖苷酶,为7-XDT转化生产紫杉醇提供了新的酶源。     

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合...     

两株生防荧光假单胞杆菌的室内筛选试验

从番茄根际土壤中筛选出11株对水稻稻瘟病菌具拮抗活性的细菌原始菌株,其发酵滤液对稻瘟菌菌丝生长抑制率达50％以上的菌株有8个。依据拮抗活性测定结果,确定AbⅢ745和AbⅢ763的单胞分离后代AbⅢ745-6和AbⅢ763-1为最优菌株,其对稻瘟病菌的抑制率分别达96.88％和78.57％,对小麦全蚀病菌、小麦根腐病菌及番茄早疫病菌也有一定的抑制作用。经初步鉴定,AhⅢ745-6和AbⅢ763-1属于假单胞菌科荧光假单胞杆菌。     

一株烟酸羟基化转化菌株的筛选和鉴定

从南京地区的土壤中筛选到一株高效转化烟酸为 6_羟基烟酸的菌株NA_1。形态及生理生化特征测定结果表明 ,NA_1菌株与假单胞菌属 (Pseudomonas)中的恶臭假单胞菌 (P .putida)种的特征基本一致。测定了该菌株的16SrDNA序列并根据 16SrDNA构建了系统发育树 ;在系统发育树中 ,NA_1菌株与恶臭假单胞菌形成一个类群 ,序列同源性为 99%。因此将NA_1菌株鉴定为恶臭假单胞菌     

南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质含量

通过高效液相色谱（HPLC）,测定了人工栽培南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质紫杉醇（taxol）、三尖杉宁碱（cephalomannine）和人工半合成紫杉醇的主要原料巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）、10 去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB）在一个生长季的含量变化.研究表明：从4月新枝叶萌发至11月枝叶基本停止生长,南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质含量季节性变化明显.其中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的最高值都出现在5月;巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的最高峰值分别出现在9月和4月.相关分析发现,南方红豆杉枝叶中4种药用活性物质之间有很好的相关性,其中紫杉醇与三尖杉宁碱含量呈显著正相关(P<0.05),三尖杉宁碱含量与10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量呈显著负相关(P<0.05).     

217株铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶状况及血清学分型的调查研究

目的了解广州地区铜绿假单胞菌（PA）3种主要β-内酰胺酶（金属β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶）的产生情况和血清型分布,观察这些铜绿假单胞菌的耐药差别.方法用法国生物梅里埃公司的VITEK-2细菌鉴定与药敏系统进行217株铜绿假单胞菌的鉴定与药敏,对可疑产金属β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶的菌株,用双纸片协同试验和头孢西丁三维试验进行3种酶的表型确证,同时采用玻片凝集试验对这些菌进行血清分型.结果217株铜绿假单胞菌的β-内酰胺酶产酶率为20.7%（45/217）,其中产金属β-内酰胺酶的有26株,占12.0%（26/217）,产AmpC酶的有11株,占5.1%（11/217）,产超广谱β-内酰胺酶的有8株,占3.7%（8/217）;对氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、亚胺培南、左旋氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸和美洛培南这些临床常用抗生素,产酶菌较不产酶菌敏感性明显降低（P均小于0.05）;217株铜绿假单胞菌的血清分型以G型为主,占39.6%（86/217）,其次为L型,占19.8%（43/217）;产酶菌株的血清型以B和L型为主.结论广州地区引起临床感染的铜绿假单胞菌产生的β-内酰胺酶以金属酶最常见,其次为AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶;产酶株对临床常用抗生素敏感性降低;广州地区铜绿假单胞菌的血清型以G型为主,产酶菌株以L和B型为主,临床上治疗铜绿假单胞菌引起的感染应根据实验室的药敏结果选择抗生素.     

不同来源的尿卟啉原Ⅲ转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B_(12)的影响

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲ methyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(uroprophyrinogen Ⅲ,urogen Ⅲ)中心碳原子C-2和C-7甲基化生成前咕啉-2,是维生素B_(12)生物合成途径中的一步关键酶。本文分别克隆了荚膜红细菌来源的RCcob A1,RCcob A2和脱氮假单胞菌来源的PDcob A,并在VB_(12)生产菌株脱氮假单胞菌中过表达和发酵。通过对三株重组菌维生素B_(12)发酵结果分析可知,SUMT(PDcob A),SUMT1(RCcob A1)和SUMT2(RCcob A2)的表达有利于维生素B_(12)产量的提高,与对照菌株相比分别提高了16.48%,10.2%和31.86%。根据摇瓶发酵的结果在5 L发酵罐上进行了放大实验,p BBR122-PblaRCcob A2的产量为144.5 mg/L,相比对照菌p BBR122-Pbla(111.3 mg/L)产量提高了29.83%左右。结论:SUMT的表达可以在一定程度上解除维生素B_(12)合成途径中的瓶颈,提高维生素B_(12)产量。     

产紫杉醇内生真菌N-15的分离及鉴定

产紫杉醇内生真菌的研究是解决紫杉醇药源紧缺问题的重要途径之一。本研究主要报道了从南方红豆杉树皮的内表皮中筛选得到一株产紫杉醇的内生真菌N-15,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测结果表明其提取物具有与紫杉醇及其前体巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ标准品一致的色谱特征峰和保留时间,表明真菌N-15可以产紫杉醇及其两个前体物。质谱法(mass spectrometry,MS)检测结果表明,N-15的发酵液提取物具有和紫杉醇标准品相同质谱特征峰,进一步说明N-15可以产紫杉醇。通过结合形态特征观察和18S rRNA序列分析,将N-15初步确定为黑孢霉属(Nigrospora sp.)真菌。     

具胶原蛋白酶活性铜绿假单胞菌的筛选*

从成都皮革厂等堆积废弃毛皮、皮革的场所采集土样,通过以明胶为主要基质培养基进行富集和初筛,获得95株有明胶酶活性菌株。挑选其中28株明胶酶活性较高的菌株进行牛皮消化试验,有12株菌能在48h内完全消化小牛皮。以Ⅲ型酸溶性胶原为底物,测定了12株菌发酵培养液中胶原蛋白酶活性,确认这12株菌都具有胶原蛋白酶活性,酶活力基本相同,约10-16U／mL。经形态观察、生理生化特征分析及BIOLOG微生物鉴定仪鉴定,这12株菌分为两类,分别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeraginosa)和火神发光杆菌(Photobacterium logei)(结果另发表)。对铜绿假单胞菌产生胶原蛋白酶粗酶性质进行了研究,其酶活最适温度为32℃,最适pH为7．5,可以被金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA部分抑制,不能被PMSF抑制。对铜绿假单胞菌产胶原蛋白酶发酵条件的研究表明,不仅培养基中氮源、碳源和金属离子影响产酶量,而且发酵工艺对胶原蛋白酶的产生也有较大影响。     

产脂肪酶嗜碱细菌的筛选及酶学性质研究

目的:筛选产脂肪酶嗜碱细菌,并研究其酶学性质.方法:以豆油为唯一碳源的固体平板筛选产酶菌株,16S rDNA同源性分析确定微生物菌属,单因素实验优化产酶条件、研究酶学性质.结果:筛选出1株产脂肪酶的嗜碱菌株,鉴定为假单胞菌(Pseudomonas),命名为Pseudomonas sp.C-36.菌株产酶的最佳培养条件为:甘油2%(V/V).蛋白胨0.7%(W/V),酵母提取物0.5%(W/V),K2HPO4 0.2%(W/V),MsS04·7H2O 0.05%(W/V),NaCl 0.3%(W/V),Triton X-100 0.01%(W/V),pH 9.5,转速180r/min,37℃下培养24h,产酶量为2.782 IU/ml.该酶的最适温度和pH分别为40℃和9.0,50℃时酶活半衰期为2h.Ca2+等金属离子对该酶酶活具有促进作用,而Zn2+对酶活的抑制作用明显.有机溶剂的耐受性实验表明,该酶在疏水性有机溶剂中稳定性良好.结论:筛选得到1株嗜碱的脂肪酶产生菌C-36,并鉴定为Pseudomonas.     

红豆杉内生真菌中巴卡亭Ⅲ产生菌的筛选及培养基的初步优化

目的:筛选出产巴卡亭Ⅲ的红豆杉内生真菌,为抗癌药物紫杉醇提供一个新的来源。方法:从云南红豆杉树皮中分离纯化出内生真菌,对其进行液体发酵培养,过滤,收集菌丝体并破碎,用二氯甲烷萃取,萃取液进行薄层层析,与巴卡亭Ⅲ标准品有相同比移值的样品再利用高效液型色谱与标样进行比照,进而筛选出产巴卡亭Ⅲ的内生真菌。同时以发酵培养基基础,对筛选出的真菌进行碳源和氮源的优化。并在此基础上探讨几种常见的紫杉烷类化合物代谢诱导剂乙酸钠、苯甲酸钠、苯丙氨酸和亮氨酸的浓度对巴卡亭Ⅲ积累的影响。结果:得到一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌NSZJ043,该菌株易培养,生长迅速,经鉴定属于曲霉属。NsZJ043产巴卡亭Ⅲ的培养条件的初步优化结果表明:最适碳源、氮源分别是蔗糖和蛋白胨;在含20g/L蔗糖、1．5g/L蛋白胨、0．1 mmol/L乙酸钠、0．01mmol/L苯甲酸钠的优化培养基中培养8d,巴卡亭Ⅲ含量为34．6μg/L。结论:筛选出一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌,其具有优良的发酵特性,巴卡亭Ⅲ前体物质苯甲酸钠和乙酸钠对巴卡亭Ⅲ的合成有促进作用;苯丙氨酸和亮氨酸对其含量影响不显著,优化后NSZJ043产巴卡亭Ⅲ含量有较大的提高。     

海洋交替假单胞菌QD1-2抗肿瘤活性辅酶Q衍生物的分离与结构鉴定

海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas rubra QD1-2)是从青岛海域分离筛选出的一株具有抗肿瘤活性的菌株。为了明确海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas rubra QD1-2)的抗肿瘤活性成分和结构,利用大孔树脂柱层析、半制备HPLC等分离方法,首次从菌株QD1-2发酵液中分离到了一个单体化合物。通过高分辨率质谱、一维和二维核磁共振波谱等现代波谱技术进行结构鉴定,经测定,分子量为320,分子式为C18H24O5,为辅酶Q2衍生物。最后利用MTT法进行抗肿瘤活性测试,显示了较强的抗肿瘤活性。这一结果揭示了海洋交替假单胞菌产生新颖抗肿瘤化合物巨大的潜力,该属为寻找新型抗肿瘤天然化合物提供了新的来源。     

产紫杉醇内生真菌MHZ-32的鉴定

从曼地亚红豆杉树皮内表皮分离获得一株内生真菌MHZ-32,通过高效液相色谱法检测发现,内生真菌MHZ-32的紫杉醇提取物中含有与紫杉醇标品 (15.02 min）、巴卡亭Ⅲ标品 (7.07 min)保留时间相近的色谱特征峰. 进一步通过质谱法检测发现,MHZ-32的紫杉醇提取物中具有与紫杉醇标品((M+Na)+=876)、巴卡亭Ⅲ标品((M+Na)+=609)相同的质谱特征峰,表明内生真菌MHZ-32可以产紫杉醇和巴卡亭Ⅲ. 其紫杉醇和巴卡亭III的产量分别约为0.6 μg/g和0.2 μg/g（紫杉醇或巴卡亭Ⅲ/菌丝干重）.并通过18S rRNA序列分析和形态学鉴定,将内生真菌MHZ-32初步鉴定为拟茎点霉属（Phomopsis sp.）真菌.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌相关耐药基因的检测

目的对耐亚胺培南（IMP）的铜绿假单胞菌（IRPa）相关耐药基因进行检测。方法 2003年至2009年从临床标本中分离到（P.aeruginosa）共220株,采用三维试验筛选产β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌,应用普通PCR和多重PCR分别检测碳青霉烯酶基因和质粒携带的C类头孢菌素酶（AmpC酶）耐药基因,应用荧光定量RT-PCR的方法检测oprD2基因的表达情况。结果共检出43株产β-内酰胺酶的菌株,其中产AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、金属β-内酰胺酶（MBLs）和未知酶菌株的构成比分别58.14%（25/43）、18.60%（8/43）、4.65%（2/43）和16.28%（7/43）。74株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中,有2株菌携带IMP-9基因,1株菌携带DHA质粒型AmpC酶基因,其他碳青霉烯酶基因检测为阴性。40株菌株oprD2基因表达蛋白量降低,34株oprD2基因表达蛋白量正常。结论 oprD2基因的突变或蛋白表达量降低是IRPa对亚胺培南耐药的主要原因,AmpC酶可水解亚胺培南可能与铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药有一定的关系,而KPC-1酶和MBLs在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制中不是主要因素。     

南极抗细菌活性菌株的筛选及系统发育分析

分别以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、青枯假单胞菌、绿脓假单胞菌和苏云金芽孢杆菌为指示菌,采用琼脂扩散法对实验室保存的580株极地细菌进行了抗菌活性菌株的筛选与活性验证,从中筛选出4株对上述指示菌株具有明显抗菌效果的活性菌株,其编号分别为97、Z11、Z18及Z19,并对其生长曲线、抗菌活性曲线和系统发育地位进行研究。结果表明,4株菌均在培养24 h后进入指数生长期,菌株97在培养48 h后达到稳定期,而菌株Z11、Z18及Z19在培养60 h后达到稳定期。抗菌活性分别在培养84、96、72和72 h时达到最高。系统发育分析表明,该4株菌分别属于伦黑墨氏菌属(Rheinheimera)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。