人神经黑色素选择性导致多巴胺能神经细胞进行性变性

目的 探讨从中脑黑质致密带（SNpc）提取的人神经黑色素（HNM）对多巴胺（DA）能神经细胞的作用及机制。方法 （1）5μg/mLHNM处理中脑神经-胶质细胞混合培养体系10d后,检测DA能神经细胞摄取能力、计数酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经细胞数、测量神经突起长度并观察细胞形态变化。（2）对比检测DA能与γ-氨基丁酸（GABA）能神经细胞的摄取能力,并计算此两种神经细胞摄取能力的差异;分别计数DA能神经细胞及全部神经细胞数并计算其差异。（3）检测神经-胶质细胞、纯神经细胞及神经-星形胶质细胞等3种培养体系中DA能神经细胞摄取能力。结果 （1）5μg/mLHNM组的DA能神经细胞摄取能力、TH（＋）神经细胞数和神经突起长度分别为HNM空白对照组（对照组）的36%、41%和40%,差异均具统计学意义（分别P〈0.001,P〈0.05,P〈0.001）;DA能神经细胞形态学发生明显变化。（2）DA能与GABA能神经细胞摄取能力的平均差异为28%（P〈0.005）;细胞处理第7、10天,两种细胞摄取能力的差异分别为26%和29%（P〈0.05,P〈0.01）;DA能及全部神经细胞数的差异为33%（P〈0.01）。（3）在上述3种培养体系中,5μg/mLHNM组DA能神经细胞摄取能力分别降低为对照组的49%、81%和83%,前两者差异具统计学意义（P〈0.01）。结论 （1）HNM可从功能与形态上损伤DA能神经细胞,且损伤具选择性;（2）小胶质细胞促进了HNM对DA能神经细胞的损伤作用。（3）HNM可能是PD发病的内源性因素之一,为其制造PD新模型提供了一定的理论依据。     

阿尔茨海默病患者表现帕金森病样临床特征的机制

目的 探讨阿尔茨海默病(AD)患者表现帕金森病(PD)样临床特征的机制.方法 用0.5、1.0和2.0μmol/L β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42处理Fischer 344大鼠、小胶质细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(亦称吞噬细胞氧化酶,PHOX)野生型(PHOX / )及其基因敲除(PHOX-/-)小鼠的中脑神经元-胶质细胞、神经元-星形胶质细胞和小胶质细胞培养体系:(1)检测多巴胺(DA)能神经元摄取能力;(2)计数酪氮酸羟化酶阳性(TH )DA能神经元数并观察细胞形态;(3)对小胶质细胞进行补体受体-3抗体(OX-42)染色并观察细胞形态;(4)检测小胶质细胞中超氧化物(O2)和细胞内活性氧类物质(iROS)水平.结果 (1)在大鼠神经元-胶质细胞中,0.5、1.0和2.0μmol/L Aβ组DA能神经元摄取能力分别为对照组的72%、61%和54%,TH 神经元数分别为对照组的77%、64%和52%,与对照组比较差异均具统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);DA能神经元胞体皱缩,胞浆淡染,神经突起数目减少、变短、变细,严重时中断甚至消失.(2)在大鼠神经元-星形胶质细胞中,0.5、1.0和2.0 Fmol/L Aβ组DA能神经元摄取能力分别为对照组的94%、96%和92%,与神经元一胶质细胞的结果比较差异均具统计学意义(均P＜0.01);小胶质细胞体积明显增大,胞浆深染,形状不规则;小胶质细胞产生的O2分别为对照组的194%、250%和300%,iROS分别为44、65和84荧光单位,与对照组比较差异均具统计学意义(均P＜0.01);(3)在PHOX / 和PHOX-/-小鼠,0.5、1.0和2.0 μmol/L Aβ组DA能神经元摄取能力分别为对照组的69%、64%、51%和91%、86%、80%,前组明显低于后组(P＜0.05,P＜0.01);产生的O2 分别为对照组的167%、250%、317%和88%、49%、61%,产生的iROS分别为14、38、164和0、12、80荧光单位,前组均明显高于后组(P＜0.05,P＜0.01);PHOX / 小鼠DA能神经元胞体及突起的损伤明显重于PHOX-/-小鼠.结论 Aβ通过PHOX从功能及形态上激活小胶质细胞,损伤DA能神经元,可能是AD患者出现PD样临床特征的机制,这为抑制小胶质细胞的PHOX成为治疗神经变性疾病的新靶点提供了一定依据.     

凝血酶诱导小胶质细胞激活与黑质多巴胺能神经元变性关系的研究

目的探讨凝血酶诱导小胶质细胞激活与黑质多巴胺（DA）能神经元变性的关系。方法采用脑立体定向术将凝血酶注射人大鼠黑质，采用尼氏（Nissl）染色、酪氨酸羟化酶（TH）及特异性小胶质细胞表面补体受体（CR3）单克隆抗体（OX-42）标记免疫组织化学染色，观察凝血酶注射人大鼠黑质后不同时间点TH阳性多巴胺能神经元数量及小胶质细胞的激活情况。结果凝血酶注入黑质4h后小胶质细胞开始呈现“灌木丛样”或少量呈现阿米巴样；12h小胶质细胞数目明显增加且绝大部分呈现阿米巴样；24h已完全激活，“阿米巴样”细胞达高峰；3d维持高峰；14d后小胶质细胞染色变淡，体积变小，阿米巴样细胞数目下降。TH阳性细胞数在第3d开始下降，第7d有大量的TH阳性细胞丢失，与对照侧相比下降达约53％（P〈0．01），高倍镜下可见胞体皱缩、突起明显缩短或减少，14d时细胞数下降至21％，30d时约为12％（P〈0．01）。结论凝血酶对DA能神经元具有一定的损毁作用，小胶质细胞的激活先于DA能神经元变性，其活化可能参与DA能神经元变性。     

铁选择性损伤多巴胺能神经元的神经免疫炎症机制

目的 在模拟人中脑黑质的多种原代细胞培养体系中,研究铁对多巴胺能神经元的损伤及其神经免疫炎症机制.方法 采用5、25和100μmol/L的Fecl2(Fe2+):(1)处理中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系,7 d后计数酪氨酸羟化酶(TH)(+)多巴胺能神经元及抗神经特异性核蛋白抗体(Neu-N)(+)的全部神经元的数量,观察神经元形态,研究Fe2+对多巴胺能神经元的选择性损伤;(2)同时处理中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系和神经元-星形胶质细胞培养体系,7 d后计数TH(+)多巴胺能神经元的数量,研究小胶质细胞在Fe2+选择性损伤多巴胺能神经元中的作用;(3)处理原代小胶质细胞培养体系,测量细胞外超氧化物(O2·-)及细胞内活性氧类物质(iROS),研究Fe2+激活小胶质细胞导致的功能变化;(4)处理中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系,7 d后计数抗补体受体-3(OX-42)(+)小胶质细胞的数量,观察细胞形态,研究Fe2+激活小胶质细胞导致的形态学变化.结果 (1)5、25和100μmol/L Fe2+处理组TH(+)多巴胺能神经元的数量分别为对照组的89%、70%和55%,其中25、100 μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(F=12.047,P＜0.01);多巴胺能神经元胞体皱缩,胞质淡染,神经突起数目减少;(2)5、25和100 μmol/L Fe2+处理组Neu-N(+)全部神经元的数量分别为对照组的100%、104%和101%,与对照组比较差异均无统计学意义;5、25和100μmol/L Fe2+处理组Neu-N(+)全部神经元的数量与TH(+)多巴胺能神经元数量的差值分别为11%、34%和46%,其中25和100 μmol/L Fe2+处理组两种神经元数量的差异具有统计学意义(分别为t=8.098,P＜0.05;t=11.218,P＜0.05);(3)在中脑原代神经元-小胶质细胞-星形胶质细胞混合培养体系和神经元-星形胶质细胞培养体系中,25μmoL/L Fe2+处理组TH(+)多巴胺能神经元的数量分别为对照组的70%和98%,差值为28%,差异具有统计学意义(t=8.061,P＜0.05);100 μmoL/LFe2+处理组TH(+)多巴胺能神经元的数量分别为对照组的55%和75%,差值为20%,差异具有统计学意义(t=9.025,P＜0.05);(4)5、25和100μmoL/L Fe2+处理组产生的细胞外O2·-分别为对照组的100%、127%和163%,其中100 μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(t=9.015,P＜0.005);5、25和100μmol/L Fe2+处理组产生的iROS分别为对照组的147%、172%和231%,其中25和100μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(F=3.091,P＜0.05);(5)5、25和100 μmol/L Fe2+处理组OX-42(+)小胶质细胞数量分别为对照组的183%、190%和240%,其中25和100μmol/L Fe2+处理组与对照组比较差异具有统计学意义(F=6.101,P＜0.01);小胶质细胞激活后胞体变大,形状不规则.结论 Fe2+激活小胶质细胞,使其形态发生显著变化,并产生大量神经毒性因子,选择性损伤多巴胺能神经元;为抑制铁过度激活小胶质细胞成为治疗PD的新策略提供依据.

Abstract：

Objective To investigate the role and neuroinflammatory mechanism of iron on dopamine ( DA) neurons in multiple primary midbrain cultures that mimic human substantia nigra pars compacta.Methods Ferrous chloride ( Fe2+ ) with the desired concentrations of 5,25 and 100 μmol/L was used to ( 1 ) treat primary midbrain neuron-microglia-astroglia cultures for 7 days and the numbers of DA neurons and total neurons were counted after tyrosine hydroxylase (TH) and neuron-specific neuclear protein neurons in 5,25 and 100 μmol/L Fe2 + -treated groups were 89%,70% and 55% of control group,and 25,100 μmol/L Fe2+ significantly decreased DA neuronal numbers compared with control group ( F = 12.047,P ＜0.01);DA neuronal bodies were shrunk and smaller,cytoplasmic stainings were reduced,neuronal dendrites were decreased;(2) The numbers of Neu-N ( + ) total neurons in 5,25 and 100 μmol/L Fe2+-treated groups were 100%,104% and 101% of control group and Fe2+ did not decrease DA neuronal numbers compared with control group (t =4.458,P ＞ 0.05 );5,25 and 100 μmol/L Fe2+-induced difference between total neurons and DA neurons were 11%,34% and 46%,and 25 and 100 (Amol/L Fe2+ produced significant difference(t =8.098,P ＜0.05;t = 11.218,P＜0.05);(3) In primary midbrain neuron-microglia-astroglia and neuron-astroglia cultures,the numbers of DA neurons in 25 μmol/L Fe+-treated group were 70% and 98% of control group,respectively.The difference between two groups was 28%,which was statistically significant (t =8.061,P＜0.05);The numbers of DA neurons in 100 μmol/L groups were 183%,190 % and 240% of control group,and 25 and 100 μmol/L Fe2 + significantly increased microglial numbers compared with control group ( F = 6.101,P ＜ 0.01 );dramatic changes of microglial morphology were indicated by the enlarged cell bodies and irregular shape.Conclusions Fe2 + provokes selective DA neuronal damage and microglia are the mediators of the neurotoxic effect,which may be due to microglial over-activation featured by the significant production of neurotoxic factors and morphological changes of microglia.This investigation cast a new light for PD therapy by inhibiting Fe2+ -induced neuroinflammation characterized by the microglial over-activation.     

小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子保护多巴胺能神经元的实验☆

背景：目前尚未见骨髓间充质干细胞对活化的小胶质细胞特异性反应的报道，且有关骨髓间充质干细胞在特定微环境下如何维持多巴胺能神经元的存活也缺乏相应的实验证据。 目的：观察骨髓间充质干细胞在活化的小胶质细胞刺激下保护多巴胺能神经元存活的作用。 方法：取Wistar大鼠，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，体外培养并活化小胶质细胞，酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。实验分为5组：骨髓间充质干细胞组；小胶质细胞组；脂多糖+小胶质细胞组；骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组；分别取各实验组的培养上清，对中脑多巴胺神经元进行培养。单纯多巴胺能神经元组采用体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12进行培养。采用免疫荧光技术检测不同微环境对多巴胺能神经元存活的影响及不同微环境对骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子的影响。 结果与结论：含有骨髓间充质干细胞的实验组胶质细胞源性神经营养因子的释放量均较相应的对照组高。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现，单纯多巴胺能神经元组神经元的存活率为15%；小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为10%；骨髓间充质干细胞组多巴胺能神经元的存活率为35%；脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为5%；而骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率达到了28%，高于除骨髓间充质干细胞组外的其他各组(P < 0.05)。此外体外培养多巴胺能神经元存活率随培养时间延长下降，但含有骨髓间充质干细胞实验组的多巴胺能神经元存活率明显高于相应对照组。提示小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞上调胶质细胞源性神经营养因子表达，使得多巴胺能神经元免受毒素的损害，抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡。     

美满霉素对脂多糖诱导帕金森病模型多巴胺能神经元保护作用的研究

目的 探讨美满霉素（Mino）对脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞（Mic）激活的抑制作用和对黑质多巴胺能（DA）神经元的保护作用。方法 20只雄性SD大鼠随机分为单纯LPS干预组和LPS＋Mino干预组（n=10）。并设5只生理盐水注射作为对照组。于不同时间点观察各组大鼠行为学改变．并采用免疫组织化学、原位杂交、Western blot等方法观察Mic的激活情况以及酪氨酸羟化酶（TH）神经元、mRNA、蛋白的表达水平。结果 LPS＋Mino组在LPS诱导后7d、14d的旋转次数均较单纯LPS组明显减少：两组均以激活型Mic为主，LPS＋Mino组“阿米巴样”Mic数目较单纯LPS组明显减少，尚存有少许“分枝样”Mic；LPS诱导后两组术侧中脑OX-42蛋白水平较对照组均明显增高。LPS＋Mino组增加水平显著低于单纯LPS组（P〈0．01）；2组术侧中脑TH阳性神经元数量、mRNA、蛋白水平均较对照组明显下降，单纯LPS组下降水平显著高于LPS＋Mino组（P〈0．01）。结论 Mino干预可显著抑制LPS诱导的Mic激活，减轻LPS对黑质DA能神经元的毒性作用。     

帕金森炎症细胞模型的建立与炎症机制的研究

目的观察脂多糖（LPS）对小鼠中脑原代多巴胺能神经元的损伤作用。方法取孕13d的C57/BL小鼠胚胎中脑原代培养,以LPS为工具药激活小胶质细胞,通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞荧光染色,计数TH阳性细胞数目并观察形态的变化,ELASA法观察炎症因子的变化。结果 不同浓度LPS（0.1、1.0和10.0mg/L）处理72h与相同浓度LPS（1mg/L）不同时间点（8h、24h、72h）分别处理原代混合细胞多巴胺神经元,TH阳性细胞减少,大部分细胞表现为突起数目的减少,突起变短并有串珠样改变。分泌细胞因子TNF-α含量与给药组相比显著增多（P〈0.001）。结论 LPS通过激活小胶质细胞释放TNF-α发挥对多巴胺能神经元的损伤作用。     

小胶质细胞与帕金森病

帕金森病是常见神经系统变性疾病,以中脑黑质多巴胺(DA)神经元变性坏死和患者脑内出现Lewy小体为主要病理特点。神经元缺失的同时伴胶质细胞反应,尤其是小胶质细胞激活,近年来诸多证据显示小胶质细胞激活可以介导活性氧产物,致炎性细胞因子、一氧化氮等相关产物的神经毒性作用,干预小胶质细胞激活有助于阻止PD进程。本文综述小胶质细胞在PD中的神经破坏作用以及目前药物干预治疗的进展。     

MPP对培养中脑多巴胺能神经元的影响

目的:通过观察MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺及胆碱摄取能力、多巴胺含量变化及细胞形态的改变等,研究MPP+对中脑多巴胺能神经元功能的影响,探讨利用MPP+建立体外PD细胞模型的可能性及实际意义.方法:用孕14天Wistar大鼠,氯胺酮麻醉后取胚胎,按本室常规方法分离培养中脑多巴胺能神经元,培养至第7天后将不同浓度的MPP+加入培养有神经元的培养基中,使其终浓度分别为0.1μM,1μM,10μM.分别测定不同时相点[3H]多巴胺和[3H]胆碱摄取能力及细胞内多巴胺含量变化,并进行TH免疫细胞化学染色.结果:MPP+浓度为0.1μM、1μM和10μM时,其[3H]多巴胺摄取力分别是为6.2±0.7、5.9±0.5、5.4±04,较之对照组100±1.7的结果看,MPP+对中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显抑制作用(P＜0.05);而[3H]胆碱摄取力其值为98±3.1,较之对照组100±2.4,差异不显著,说明MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取力无抑制作用(P＞0.05).另一个有趣的结果是胶质细胞的存在对MPP+的作用有明显影响,未抑制胶质细胞组其作用明显强于抑制胶质细胞组(P＜0.05);同时MPP+使中脑多巴胺能神经元细胞内多巴胺含量明显减少(P＜0.05);TH阳性细胞明显减少(P＜0.05).结论:MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显的抑制作用,不仅使多巴胺的摄取降低,而且细胞内的多巴胺含量也显著减少,TH免疫组化染色结果也支持这一结果.MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取能力无明显抑制作用.     

MPP+对培养中脑多巴胺能神经元的影响

目的通过观察MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺及胆碱摄取能力、多巴胺含量变化及细胞形态的改变等,研究MPP+对中脑多巴胺能神经元功能的影响,探讨利用MPP+建立体外PD细胞模型的可能性及实际意义.方法用孕14天Wistar大鼠,氯胺酮麻醉后取胚胎,按本室常规方法分离培养中脑多巴胺能神经元,培养至第7天后将不同浓度的MPP+加入培养有神经元的培养基中,使其终浓度分别为0.1μM,1μM,10μM.分别测定不同时相点[3H]多巴胺和[3H]胆碱摄取能力及细胞内多巴胺含量变化,并进行TH免疫细胞化学染色.结果MPP+浓度为0.1μM、1μM和10μM时,其[3H]多巴胺摄取力分别是为6.2±0.7、5.9±0.5、5.4±04,较之对照组100±1.7的结果看,MPP+对中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显抑制作用(P＜0.05);而[3H]胆碱摄取力其值为98±3.1,较之对照组100±2.4,差异不显著,说明MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取力无抑制作用(P＞0.05).另一个有趣的结果是胶质细胞的存在对MPP+的作用有明显影响,未抑制胶质细胞组其作用明显强于抑制胶质细胞组(P＜0.05);同时MPP+使中脑多巴胺能神经元细胞内多巴胺含量明显减少(P＜0.05);TH阳性细胞明显减少(P＜0.05).结论MPP+对体外培养的中脑多巴胺能神经元多巴胺摄取力有明显的抑制作用,不仅使多巴胺的摄取降低,而且细胞内的多巴胺含量也显著减少,TH免疫组化染色结果也支持这一结果.MPP+对多巴胺能神经元胆碱摄取能力无明显抑制作用.