RAS蛋白在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生长的影响

目的 探讨RAS蛋白在胶质瘤中的表达及其对人脑胶质瘤细胞生长的影响.方法 用免疫组化染色法检测RAS蛋白在正常脑组织及各级别胶质瘤组织中的表达水平,并采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法和流式细胞技术检测降低RAS活性后U251细胞的增殖和凋亡情况;用Western印迹法检测ERK和AKT信号通路.结果 胶质瘤组织中RAS的表达随胶质瘤恶性程度增高而增强.抑制RAS 蛋白活性后,RAS信号通路的下游分子ERK和AKT蛋白磷酸化水平降低;U251胶质瘤细胞生长受抑制,细胞生长阻滞在G1期且凋亡增加.结论 RAS蛋白在胶质瘤中高表达,抑制其活性可下调ERK和AKT 信号通路,进而调控细胞的生长.     

SEPT7基因抑制人胶质瘤细胞系U251MG侵袭的研究

目的 研究SEPT7基因对人胶质瘤细胞系U251MG侵袭的抑制作用及其可能的分子机制.方法 以腺病毒为载体转导SEPT7(rAd5-SEFF7)入U251人脑胶质瘤细胞系;Transwell法和3-D Matrigel法观察U251胶质瘤细胞侵袭能力的变化,划痕实验和2-D Matrigel法观察细胞迁移能力的变化.应用蛋白印记检测MMP2,MMP9,MT1-MMP,TIMP1和TIMP2的表达变化,蛋白印记和免疫荧光检测整合素αvβ3的表达,以及应用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白tubulin-α结构的变化.结果 转染SEPT7后U251MG细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制、细胞MMP2、MMP9、MT1-MMP和整合素αvβ3的表达下调、TIMP1和TIMP2的表达则上调;肿瘤细胞的微管蛋白tubulin-α结构出现了重新分布,发生了扭曲及聚集现象,接近于正常的非肿瘤细胞的tubulin-α结构.结论 SEPT7基因可以抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力,其分子机制可能通过逆转MMPs/TIMPs的失衡状态,降低整合素αvβ3的表达,以及改变细胞骨架tubulin-α的结构而实现的.SEPT7可作为基因治疗胶质瘤的重要候选基因.     

沉默PAK4基因对胶质瘤细胞U251侵袭与迁移能力的影响

目的观察沉默P21活化酶4(p-21 activated kinase 4, PAK4)基因对神经胶质瘤细胞U251侵袭与迁移能力的影响。方法构建稳定沉默PAK4基因的U251细胞系,shRNA-U251(转染空载组作为对照即shNC组);应用免疫荧光实验检测PAK4在胶质瘤细胞系U251中的表达;应用细胞划痕愈合实验与Transwell侵袭实验比较两组细胞的迁移与侵袭能力的变化;通过Western blotting实验检测沉默PAK4基因后U251细胞系中基质金属蛋白酶MMP2与MMP9的表达改变。结果 PAK4蛋白主要表达于胶质瘤细胞系U251细胞核与细胞质; shRNA-U251组细胞划痕愈合率明显降低; shRNA-U251组细胞进入小室下壁的数量明显减少,shRNA-U251组细胞MMP2与MMP9蛋白的表达水平显著下调。结论沉默PAK4基因下调神经胶质瘤细胞U251的迁移与侵袭能力与降低基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达相关。     

Bmi-1促人胶质瘤SNB19细胞生长恶化的作用机制

 目的：观察Bmi-1对人胶质瘤SNB19细胞生长恶化的影响。方法：体外培养人胶质瘤SNB19细胞,建立稳定表达Bmi-1和抑制Bmi-1表达的细胞系及空载体对照组细胞系。通过MTT、体外小室侵袭试验和血管内皮细胞成管试验检测胶质瘤细胞生长、侵袭运动和血管增生的能力。通过双萤光素酶信号报告系统和细胞免疫荧光染色检测NF-κB的活化程度。通过实时荧光定量PCR检测NF-κB下游基因表达水平。结果：Bmi-1体外增强胶质瘤细胞生长、侵袭运动和血管增生能力。高表达Bmi-1的细胞NF-κB信号通路被活化,而抑制NF-κB的活性能够抑制Bmi-1对胶质瘤细胞生长、侵袭和血管增生相关的促进作用。高表达Bmi-1的细胞其NF-κB下游与细胞生长、侵袭运动及血管增生相关的基因的表达被上调。结论：Bmi-1在人胶质瘤SNB19细胞生长过程中起到重要促进作用,其作用机制可能与活化NF-κB进而增强相关基因的表达有关。     

Raptor对胶质瘤细胞侵袭能力的影响

 目的：研究Raptor对于胶质瘤细胞侵袭能力的影响。方法：采用RNA干扰技术,向胶质瘤U87细胞转染Raptor限定性siRNA干扰质粒, Western blotting检测转染后细胞Raptor的表达水平以鉴定转染效果。体外侵袭实验检测Raptor表达降低后,U87细胞侵袭能力的变化;Western blotting检测细胞中ARK5的磷酸化情况和MMP-2、MMP-9的表达水平。免疫组织化学法检测低级别及高级别胶质瘤中Raptor的表达水平。结果：转染Raptor siRNA质粒的U87细胞命名为siRaptor/U87,转染对照组质粒的细胞命名为Scr/U87,转染成功的实验组细胞Raptor的表达降低。体外侵袭实验中siRaptor/U87较对照组穿透基质膜的细胞数少(P＜0.01)。Western blotting显示实验组细胞中磷酸化ARK5、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平均较对照组低。胶质瘤组织中Raptor的表达与恶化程度存在相关性（P＜0.01）。结论：Raptor 表达降低可能通过磷酸化ARK5及增加MMP-2、MMP-9的表达促进胶质瘤细胞的侵袭力。     

小RNA干扰骨桥蛋白抑制人U251细胞的体外生长与侵袭

目的:研究慢病毒载体介导的骨桥蛋白(OPN) RNA干扰对人U251神经胶质瘤细胞体外生长和侵袭的影响,并探讨其对神经胶质瘤生长、侵袭的可能机制.方法:应用本实验室已构建并鉴定的OPN特异性短发卡RNA慢病毒表达载体(LV-OPN shRNA)感染U251神经胶质瘤细胞.RT-PCR检测干扰前、后U251细胞OPN mRNA的表达;免疫印迹法检测干扰前、后U251细胞OPN、MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力的变化;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化;细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果:与未感染组、空载体感染组相比,LV-OPN shRNA感染组OPN mRNA、OPN蛋白及MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达均明显下降;LV-OPN shRNA感染组细胞增殖、侵袭能力及迁移能力也明显下降.结论:慢病毒载体介导的骨桥蛋白RNA干扰在体外能抑制U251细胞OPN mRNA和蛋白表达, 进而抑制U251细胞在体外的生长及侵袭,因此可以推测OPN是促进胶质瘤增殖和侵袭的基因之一,为胶质瘤的治疗提供新的靶点.     

miR-205通过靶向调控TBX18抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力

目的:探讨微小RNA-205(miR-205)在神经胶质瘤组织中的表达模式及其在胶质瘤细胞侵袭中的作用及可能机制。方法:用real-time PCR检测配对神经胶质瘤组织中miR-205的表达,同时用免疫组化方法检测配对组织中TBX18蛋白的表达量;用脂质体将miR-205模拟物(miR-205 mimics)、miR-205抑制物(miR-205 inhibitor)以及相应对照(control)导入U251胶质瘤细胞后,Transwell实验检测细胞的侵袭能力变化;生物信息学分析结合萤光素酶报告基因实验观察miR-205对TBX18的靶向调控作用;采用RNA干扰技术下调U251细胞中TBX18的表达,用Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。结果:miR-205在82.6%所检测的神经胶质瘤组织中表达下调,而TBX18在神经胶质瘤组织中表达上调,两者表达呈负相关;过表达miR-205使U251细胞的侵袭细胞数下降(P0.01),抑制miR-205表达后U251侵袭细胞数增加(P0.01);miR-205在U251胶质瘤细胞中能直接靶向抑制TBX18的表达,干扰TBX18的表达亦使U251细胞的侵袭细胞数下降(P0.01)。结论:miR-205在神经胶质瘤中表达下调,miR-205可能通过靶向调控TBX18影响胶质瘤细胞的侵袭能力,这将为完善胶质瘤侵袭的分子机制及开发新治疗策略以提高胶质瘤治疗效果提供有力的理论依据。     

MACC1表达沉默对胶质瘤细胞U87增殖凋亡的影响

目的探讨MACC1基因表达沉默对脑胶质瘤细胞U87增殖凋亡的影响。方法应用RT-PCR和Western blot检测55例不同病理级别胶质瘤标本MACC1表达;转染MACC1siRNA到U87细胞沉默MACC1基因表达,Western blot检测MACC1,Bcl-2/Bax,caspase-3,c-Met蛋白的表达;MTT法检测细胞生长增殖能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。结果MACC1基因在胶质瘤标本组织表达随病理级别升高而增多;MACC1表达沉默后U87生长增殖能力明显下降,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡显著增加,MACC1蛋白表达明显下降,Bcl-2/Bax比值降低,caspase-3表达上调,c-Met表达下降。结论下调MACC1表达可促进胶质瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,MACC1可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

miR-34a通过MMP2抑制脑胶质瘤细胞侵袭和转移

目的探讨miR-34a通过其靶基因基质金属蛋白酶2(MMP2)对脑胶质瘤细胞侵袭和转移的影响。方法选取U87和A172脑胶质瘤细胞,分组转染miR-34a摸拟物和抑制剂;利用RT-q PCR及Western blot观察脑胶质瘤细胞中miR-34a和MMP2的表达;经过microRNA数据库预测miR-34a与MMP2结合区域;构建MMP2 3'UTR野生型与突变型的荧光素酶质粒和miR-34a质粒,进行荧光素酶报告基因实验;Transwell侵袭和划痕实验观察U87细胞侵袭和迁移能力。结果经筛选选用MMP2高表达细胞株U87和A172,过表达miR-34a后发现MMP2表达水平降低(P0.05),降低miR-34a则MMP2表达升高(P0.05);miR-34a结合MMP2 mRNA 3'UTR的特定序列降低MMP2水平(P0.05);miR-34a通过MMP2抑制细胞侵袭和迁移(P0.05)。结论在胶质瘤细胞中miR-34a下调MMP2,进而抑制细胞侵袭和迁移能力。     

乙酰辅酶A羧化酶1对胶质瘤细胞系U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）对人胶质瘤细胞系U87细胞增殖、迁移及侵袭的作用。 方法 Western blotting检测人胶质瘤细胞系U87、U251及U373中ACC1的表达;构建ACC1过表达质粒载体,将过表达ACC1质粒载体瞬时转染至U87细胞中;Western blotting检测转染后U87细胞中ACC1表达情况;MTT实验检测过表达ACC1对U87细胞增殖的影响;Transwell迁移和侵袭实验分别检测过表达ACC1对U87细胞迁移和侵袭的影响;划痕实验检测过表达ACC1对U87细胞划痕愈合能力的影响;Western blotting检测相关蛋白表达变化。 结果 与人胶质瘤细胞系U251和U373相比,U87细胞中ACC1表达较低;ACC1过表达抑制U87细胞增殖（P<0.01）;ACC1过表达抑制U87细胞迁移、侵袭和划痕愈合能力（P<0.01）;ACC1过表达迁移和侵袭相关蛋白波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)表达下调（P<0.01）,凋亡抑制蛋白Bcl-2和细胞周期蛋白(cyclin) B、cyclin D表达下调（P<0.01）,p-STAT3蛋白表达下调（P<0.01）,细胞周期蛋白P21表达上调（P<0.01）。 结论 过表达ACC1可能通过抑制STAT3活性,抑制人胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。     

下调CENP-W对人脑胶质瘤U87细胞的影响

目的:研究下调着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)的表达水平对人脑胶质瘤U87细胞的影响。方法:采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人脑胶质瘤U87细胞CENP-W的表达,采用RT-qPCR和Western blot法评价siRNA的干扰效果,采用MTT法、BrdU实验和平板集落形成实验测定细胞的增殖,Transwell小室检测细胞侵袭力的变化,划痕实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:MTT实验、平板集落形成实验和BrdU实验显示转染siRNA的实验组U87细胞的增殖能力、集落形成能力较空白对照组及阴性对照组明显降低;Transwell实验和划痕实验显示实验组细胞的迁移、侵袭能力较空白对照组及阴性对照组明显减弱;流式细胞术分析表明实验组细胞的细胞周期被阻滞在G_0/G_1期;实验组细胞凋亡比例较对照组增多(P0.05)。结论:下调CENP-W的表达可抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进细胞的凋亡,提示CENP-W有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

SRSF9/SRp30c通过调控GRβ对胶质瘤细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨富含丝氨酸-精氨酸剪切因子9/富含丝氨酸-精氨酸蛋白30c(SRSF9/SRp30c)和糖皮质激素受体β(GRβ)在胶质瘤细胞中的表达及两者之间的关系。方法:用小干扰RNA(siRNA)靶向干扰胶质瘤U87细胞中SRSF9的表达,同时用慢病毒将短发卡RNA(shRNA)转染细胞,构建SRSF9敲减的U87稳转细胞株,通过荧光显微镜观察并检测转染情况。通过RT-q PCR和Western blot法检测SRSF9/SRp30c和GRβ的表达水平,CCK-8和细胞集落形成实验检测细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:用2种方法敲减SRSF9后,SRSF9/SRp30c表达均降低,GRβ的表达水平也随之下降,差异有统计学意义(P0.05)。荧光显微镜观察结果表明,成功构建了稳转细胞株,转染效率超过80%。CCK-8实验和细胞集落形成实验的结果表明U87细胞在敲减SRSF9后,细胞活力和集落形成能力降低,差异有统计学意义(P0.05);划痕实验结果表明U87细胞在敲减SRSF9后,迁移能力明显减弱,差异有统计学意义(P0.05)。结论:SRSF9/SRp30c可通过调控GRβ促进胶质瘤细胞的增殖和迁移。     

GDC-0032抑制U251胶质瘤细胞活力并诱导DNA损伤

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂GDC-0032对人胶质瘤U251细胞活力、细胞周期和DNA损伤的影响。方法:GDC-0032处理U251细胞,MTT实验检测细胞活力;流式细胞术分析GDC-0032对细胞周期的影响;Western blot检测细胞内蛋白表达的变化;免疫荧光检测组蛋白γ-H2AX在细胞内的表达与分布。结果:GDC-0032剂量依赖性地抑制U251细胞活力;U251细胞经GDC-0032作用后,处于G1期的细胞数量明显增多,同时p27的表达水平增加,而细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)的表达则受到抑制;在GDC-0032作用的细胞中,γ-H2AX焦点的生成和表达水平明显升高;另外,GDC-0032上调胶质瘤细胞中丝裂原活化蛋白激酶家族成员细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化水平,而survivin的表达则受到抑制。结论:GDC-0032能够通过抑制细胞活力和阻滞细胞于G1期而抑制U251细胞的增殖,并且诱导胶质瘤细胞发生DNA损伤;GDC-0032的抑癌活性与其调控ERK和JNK的活性及下调survivin的表达相关。     

Nestin在CDA-2诱导人胶质瘤细胞分化中的变化

目的： 研究nestin（巢蛋白）在人尿萃取物细胞分化剂CDA-2（又名尿多酸肽）诱导SWO-38人胶质瘤细胞分化中表达的变化及其意义。方法: 采用光镜观察和鉴定CDA-2对SWO-38细胞的分化作用;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blotting分析CDA-2诱导前后SWO-38细胞nestin表达的变化。 结果: 光镜观察发现经CDA-2诱导后SWO-38细胞胞体变大、核浆比减小、突起增多,表现出向成熟的星形细胞分化的现象;Nestin表达在细胞浆,呈丝状着色;Nestin在CDA-2诱导SWO-38细胞分化中表达下调。结论: Nestin在CDA-2诱导SWO-38细胞分化中表达下调,进一步验证nestin与细胞分化的关系,nestin有可能成为胶质瘤诱导分化治疗领域新的标志物。     

MicroRNA-483-3p对人神经胶质瘤细胞的作用

目的:探讨microRNA(miRNA)-483-3p对人神经胶质瘤细胞A172生长和迁移能力的影响及潜在作用机制。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)检测人肾胚细胞系HEK-293和不同神经胶质瘤细胞株(A172、U251和SHG44)中miRNA-483-3p的表达水平。转染miRNA-483-3p抑制序列(miRNA-483-3p inhibitor)下调A172细胞中miRNA-483-3p的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和周期分布;Transwell实验检测细胞的迁移;Western blot检测周期相关调控因子及上皮-间充质转化相关蛋白的水平。双萤光素酶报告基因分析法预测及验证其可能的靶基因。结果:miRNA-483-3p在各型神经胶质瘤细胞中高表达。沉默miRNA-483-3p后,A172细胞的活力下降并呈现出明显的周期阻滞,且细胞迁移率也显著降低。同时细胞中cyclin D1、周期蛋白依赖性激酶4、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白、N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平均显著降低,E-cadherin和β-catenin的蛋白表达水平显著升高。双萤光素酶报告基因分析显示Smad4是miRNA-483-3p的可能作用靶点,A172细胞共转染miRNA-483-3p inhibitor和Smad4 siRNA可部分逆转miRNA-483-3p介导的细胞增殖及迁移抑制。结论:沉默miRNA-483-3p可通过靶向Smad4抑制神经胶质瘤细胞株A172的生长及迁移。     

Molecular mechanism of SSFA2 deletion inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis in glioma

Gliomas are the most common primary brain malignant tumors in humans. Glioblastoma multiforme(GBM) is the most malignant intracranial tumor with a relatively poor prognosis. There promote us to find effective anti-cancer therapies to reduce cancer mortality. By using bioinformatic analysis, we found SSFA2 as a gene with elevated expression in the glioma tissues. We detected the expression of SSFA2 in glioma tissues and in the glioma cell lines, as well as in normal brain tissues. SSFA2 expression was higher in glioma tissues, especially in glioblastoma multiforme than normal brain tissues. Subsequently, we found that down-regulate SSFA2 in glioma cell lines can regulate the cell cycle to reduce the proliferation ability and induce the early apoptosis rate in shSSFA2 cells relative to control cells. Moreover, we found that down-regulate SSFA2 in glioma cell line U87(shSSFA2-U87) inhibited the growth effectiveness compared to the control cell line U87. These result reveals us that SSFA2 may act as oncogene to promote the progression of glioma. For further research specific mechanisms of SSFA2 in gliomas, we used the gene chip to detect the downstream gene in U87. We found that 30 genes also may be as target gene of SSFA2, and we testify the protein expression by western-blot. The result reveal that IL1A, IL1B and CDK6 as target gene of SSFA2 to regulate the progression of glioma. These finding suggest that SSFA2 could be a new therapeutic target for gliomas.     

CDA-2诱导胶质瘤细胞SWO-38分化并抑制其增殖的作用机制

目的： 诱导分化是肿瘤治疗的新策略，CDA-2是1种高效低毒的新型细胞分化剂，本实验研究CDA-2对人脑胶质瘤细胞SWO-38诱导分化作用并探讨CDA-2诱导分化的机制。方法: 应用MTT法检测CDA-2对SWO-38细胞活性的抑制作用、平板集落形成实验检测CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制作用、免疫组化检测SWO-38细胞GFAP的表达、Western blotting检测SWO-38细胞PPARγ、COX-2及GFAP蛋白的表达。结果: CDA-2能明显抑制人脑胶质瘤细胞SWO-38活性及增殖，其IC₅₀值分别为(2.33±0.37) g·L^-1 及(0.51±0.01) g·L^-1；3 g·L^-1 CDA-2处理SWO-38细胞72 h即表现为细胞突起增多变长，细胞高表达GFAP蛋白；同时CDA-2可诱导SWO-38细胞PPARγ表达上调和COX-2 表达下调。结论: CDA-2对胶质瘤SWO-38细胞具有增殖抑制及诱导分化作用，其作用机制可能与GFAP、PPARγ和COX-2信号转导通路有关。     

肿瘤干细胞与胶质瘤细胞起源

经过过去20年的努力,癌基因和抑癌基因在神经胶质瘤形成及发展中的核心地位已达共识.然而,在生命科学研究突飞猛进、肿瘤诊断与治疗手段日新月异的今天,我们尚未确立这些核心分子在胶质瘤中作用的靶标,因此,胶质瘤的细胞起源-这一决定着人类最终克服胶质瘤的根本问题再度引起人类的关注.     

榄香烯对人胶质瘤U251细胞的放射增敏机制

目的:探讨榄香烯对人胶质瘤U251细胞的放射增敏机制。方法:以U251细胞系为离体胶质瘤模型,用不同浓度榄香烯和不同放射剂量分别处理U251细胞,采用MTT实验检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果:榄香烯对U251细胞具有生长抑制及放射增敏作用;放疗联合榄香烯组U251细胞较放射组有更高的早期凋亡率、继发性坏死率和总死亡率;榄香烯能诱导U251细胞G2/M期阻滞;榄香烯通过降低细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)表达,导致放疗诱导的cyclin B1表达降低,从而抑制cyclin B-Cdc2复合物形成;同时抑制Cdc2蛋白第161位苏氨酸磷酸化,降低Cdc2的活性,从而诱导细胞G2/M期阻滞;另外可能通过下调survivin表达,介导细胞凋亡。结论:榄香烯可能通过下调Cdc2蛋白、降低cyclin B1表达、抑制cylcin B-Cdc2复合物的形成、下调survivin表达等方面增强U251细胞对放疗的敏感性。