细菌CpG DNA的免疫激活作用研究进展

细菌基因组DNA中以较高的频率出现非甲基化的胞嘧啶 鸟嘌呤二核苷酸 (CpGDNA) ,免疫活性细胞的Toll样受体 9(TLR9)可以识别CpGDNA并激活NF κB途径 ,活化免疫活性细胞 ,引起以Th1型为主的免疫应答 ,在诱导天然免疫、疫苗佐剂、抗肿瘤、促进造血、防治过敏性疾病等方面得到广泛应用     

CpG ODN对2型糖尿病患者外周血单个核细胞功能的影响

近年发现,有免疫刺激活性的细菌DNA和一些人工合成的寡脱氧核苷酸序列中都含有非甲基化5‘-CG-3‘二核苷酸,统称为CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)[1], 主要免疫效应为刺激单核-巨噬细胞产生细胞因子IL-12、IL-18和TNF-α,促进B细胞分泌IL-12和IL-6;通过IL-12上调NK细胞产生γ-干扰素(IFN-γ), 增强杀伤活性;通过上述一系列细胞因子和炎症细胞的相互作用,增强机体免疫能力[2].但有关CpG ODN能否改善糖尿病患者外周血单个核细胞功能的研究较少.……     

CpG ODN对2型糖尿病患者外周血单个核细胞功能的影响

近年发现，有免疫刺激活性的细菌DNA和一些人工合成的寡脱氧核苷酸序列中都含有非甲基化5＇-CG-3’二核苷酸，统称为CpG寡脱氧核苷酸（CpGODN），主要免疫效应为刺激单核-巨噬细胞产生细胞因子IL-12、IL-18和TNF-α，促进B细胞分泌IL-12和IL-6；通过IL-12上调NK细胞产生了γ-干扰素（IFN-γ），增强杀伤活性；通过上述一系列细胞因子和炎症细胞的相互作用，增强机体免疫能力。但有关CpG ODN能否改善糖尿病患者外周血单个核细胞功能的研究较少。     

CpG寡核苷酸在免疫治疗中的作用

人工合成的含有免疫刺激活性CpG基序的寡核苷酸(CpG ODN)能触发B细胞、NK细胞和T细胞以及专职抗原呈递细胞的免疫调节级联反应。对CpG ODN的反应促使机体免疫环境向Th1型细胞应答漂移以及促炎因子的释放。这成为CpG ODN在免疫治疗中作为免疫保护剂、抗变态反应以及疫苗佐剂的基础。基础研究提供了CpG ODN作用有效性的证据,正进行的临床研究将提示CpG ODN应用的安全性。本文就此相关的研究作一综述。     

含CpG基序的寡核苷酸介导的脐血抗白血病细胞作用的研究

目的　观察脐血淋巴细胞经人工合成的含不同CpG基序的寡核苷酸 (CpG ODN)作用后抗白血病细胞的效应。方法　设计合成了四种含不同CpG基序的寡核苷酸 (CpG ODN1 、CpG ODN2 、CpG ODN3和CpG ODN4 )、不含CpG基序的寡核苷酸 (nonCpG ODN)和含甲基化CpG基序的寡核苷酸(ZpG ODN) ,将其分别作用于脐血淋巴细胞 ,用MTT法测定经寡核苷酸作用后的脐血淋巴细胞对白血病K5 6 2细胞的杀伤作用 ,同时用流式细胞术分析了对脐血淋巴细胞刺激作用最强的CpG ODN3作用于脐血淋巴细胞后表面分化抗原的变化。结果　不同的CpG基序对脐血淋巴细胞有不同程度的免疫刺激作用 ,其中CpG ODN3作用后脐血NK细胞对K5 6 2细胞杀伤率最强 ,且在一定范围内呈剂量依赖性变化 ,经CpG ODN3作用后脐血淋巴细胞表面分化抗原CD3、CD4 、CD1 9、CD56 表达率分别为 (6 0 .6±7 9) %、(40 .2± 3.5 ) %、(2 2 .4± 1.9) %、(15 .5± 3.1) % ,均较作用前升高 (P值均 <0 .0 5 )。结论　不同的CpG基序对脐血淋巴细胞免疫刺激作用存在差异 ,优选后的CpG ODN3可较大程度地激活脐血淋巴细胞抗K5 6 2细胞效应 ,为提高脐血抗肿瘤效应提供了新的途径     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的：制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体，并对其生物学活性进行鉴定。 方法：实验于2003-02／12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联，透析除去未结合的多肽，与等体积的弗氏佐剂混匀后于0，2，4，6，8周对大鼠进行免疫处理，4只／次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度，α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg／L，血清稀释度从1：40开始倍比稀释，辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1：2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定，比值≥2．1为阳性。免疫结束后采血，离心取上清，与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50％，于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原，采用免疫亲和层析的方法．纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体，用Bradford对抗体进行定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度，以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析，用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。 结果：实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度：抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生，8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性：抗体浓度为0．1g／L时滴度约1：2560，并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体，具有较好的反应原性。（3）纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性：抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度，高达（139．6&;#177;15．5）％。该抗体的作用可被Prazosin阻断，降至（28．9&;#177;12．64）％，具有特异性及激动样活性。 结论：采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

肿瘤细胞淋巴细胞混合培养诱导产生胶质瘤特异性CTL的实验研究

目的 通过自身肿瘤激活诱导产生高活性的胶质瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(G-S-CTL)。方法 应用淋巴细胞、肿瘤细胞混合培养(MLTC)方法，诱导产生G-S-CTL，采用3H-TdR释放法及免疫荧光法检测G-S-CTL的细胞毒活性及免疫表型。结果 G-S-CTL与自身LAK相比，抗肿瘤活性大为提高，CD3 、CD4 、CD8 和CD25 细胞明显增多。结论 G-S-CTL抗肿瘤活性及免疫表型类似于胶质瘤浸润的淋巴细胞(GIL)，对脑胶质瘤过继免疫治疗具有一定的实用价值。     

应用~(51)Cr-白细胞粘附抑制试验检测白细胞因子的抗原依赖免疫活性

<正> 近几年来,对转移因子(TF)的研究已从非特异性免疫活性转到了特异性免疫活性方面。我们利用~(51)Cr-白细胞粘附抑制试验(~(51)Cr-LAI)检测了人白细胞因子(LF)是否也具有特异性抗原依赖免疫活性。     

T淋巴细胞及其亚群与运动免疫

已有大量的献资料表明T淋巴细胞及其亚群和人体运动免疫调节有非常重要的联系。T淋巴细胞是一种重要的免疫活性细胞，是机体免疫细胞中数目最多，作用最重要的功能细胞。T淋巴细胞亚群中的CD4细胞和CD8细胞亚群是重要的免疫调节细胞，可增强或抑制其他免疫细胞的活性。对T淋巴细胞及其亚群与运动免疫的关系，急性运动，有氧运动和长期适量运动对T淋巴细胞及其亚群的免疫功能的影响。以及T淋巴细胞及其亚群在运动免疫中作用的机制和相关影响因素进行了论述。     

CMVpp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

巨细胞病毒（CMV）感染易发生于慢性移植物抗宿主病（cGVHD）患者，其特异性免疫依赖于T细胞活性。本研究探讨CMVpp65基因修饰的树突状细胞（DC）对自身T细胞的活化作用。采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV全长pp65基因导入鼠源性DC；采用CpG—DNA诱导DC细胞成熟；采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNγ表达。结果表明：慢病毒感染DC的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为50，最佳感染效率可达30％-40％；表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naiveT细胞表达CD69；表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4^＋或CD8^＋T细胞分泌IFNγ。结论：pp65基因修饰、CpG—DNA诱导成熟的DC能体外激活CMV特异性T淋巴细胞。     

复方虫草精华对小鼠免疫功能的影响

目的：观察复方虫草精华(Lungfit，以冬虫夏草为主、黄芪为辅组成的复方制剂)对正常小鼠及环磷酰胺(CY)处理小鼠免疫功能的影响。方法：用不同剂量的Lungfit给小鼠连续灌胃10d之后，采用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应、NK细胞活性，同时测定小鼠脾脏、胸腺等免疫器官的重量。结果：Lungfit能促进PHA诱导的脾淋巴细胞增殖反应，增强NK细胞活性，使脾脏增重、胸腺缩小，并拮抗CY引起的免疫抑制作用。结论：Lungfit具有免疫增强作用。     

慢性乙肝患者外周血免疫活性淋巴细胞与病毒载量及肝细胞损伤程度的关系

目的:了解慢性乙肝患者机体的免疫状态与病毒复制及肝脏损伤的关系,以期指导临床选择最佳的治疗时机进行个体化免疫治疗.方法:选择60例慢性乙肝患者(高载量组、低载量组和阴性对照组各20例)分别采用实时免疫荧光定量、常规生化分析和流式细胞术检测其HBV-DNA载量、肝功能、肝酶学、凝血指标和外周血免疫活性细胞百分比.结果:慢性乙肝患者各免疫活性细胞百分比及肝酶学、凝血指标因体内HBV-DNA载量不同而明显不一样.高、低载量组和阴性对照组CD4/CD8分别为1.12 ±0.26、1.40 ±0.29、1.76 ±0.32.NK细胞表达分别为(7.47±3.19)%、(9.72 ±2.39)%、(11.63 ±2.77)%,CD3+细胞分别为(56.12 ±5.16)%、(62.32±4.27)%、(73.11±5.86)%.CD4+细胞分别为(34.26±3.59)%、(37.05 ±4.07)%、(41.56 ±5.32)%.CD4/CD8与白蛋白/球蛋白(A/G)呈负相关(r=-0.519 3),与凝血酶原时间(PT)呈正相关(r=0.484 0).结论:本研究发现慢性乙肝患者高载量组CD4/CD8显著低于低载量组和阴性对照组,NK细胞低于阴性对照组;阴性对照组CD4+、CD3+细胞显著高于其他两组.CD4/CD8与A/G呈负相关,与PT呈正相关,为临床利用免疫机制进行抗病毒治疗提供了实验室依据.     

CpG ODN诱导人PBMC对结肠癌细胞体外杀伤作用的研究

目的以CpG ODN为免疫佐剂激活人外周血单个核细胞（PBMC）,观察激活的PBMC对肿瘤细胞的杀伤活性。方法分别以肿瘤抗原（Ag）、白细胞介素-2（IL-2）和CpG ODN单独或联合刺激正常人和肿瘤患者PBMC,测定其对肿瘤细胞的杀伤活性。结果以CpG ODN刺激人PBMC组的细胞,其对肿瘤细胞的杀伤活性明显高于对照组（P〈0.05）。结论 CpG ODNI、L-2与肿瘤抗原共同刺激能有效提高人PBMC的杀伤活性。     

海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞植入镇痛治疗中人体的免疫反应

目的：了解海藻酸钙一聚赖氨酸一海藻酸钙(A队)微囊化牛肾上腺嗜铬细胞(APA-BCC)植入蛛网膜下腔后患者的免疫反应。方法：实验于2002-07／2003-02在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成。采用腰椎穿刺术，将APA-BCC注入20例中、重度癌痛患者L3-4或L4-5蛛网膜下腔内。检测患者移植前后的血象、免疫球蛋白、T细胞亚群及脑脊液。结果：移植后外周血中淋巴细胞比例较移植前无明显变化(P＞O．05)。移植后7d复查16例患者的脑脊液，其中8例(50％)脑脊液中白细胞升高，范围在(15～700)&;#215;l0^6L^-1[(198&;#177;248)&;#215;1O^6L^-1]。但外周血免疫球蛋白、T细胞亚群较移植前无明显变化。结论：APA-BCCs微胶囊植入癌痛患者蛛网膜下腔，未引起宿主明显的免疫反应，表明APA微囊具有良好的免疫隔离作用。     

HAC70抗原肽复合物诱导的对艾氏腹水瘤细胞杀伤活性的实验研究

目的观察从艾氏腹水瘤小鼠瘤细胞中提取的热休克蛋白70-抗原肽复合物(HAC70)诱导的抗肿瘤免疫效应,探讨其临床应用。方法提取热休克后的小鼠艾氏腹水瘤细胞经肝素-琼脂糖亲和层析纯化,制成热休克蛋白-肽复合物疫苗,以体内免疫法检测HAC70的抑瘤作用,3H-TdR掺入释放法检测脾细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果经HAC70免疫的荷瘤小鼠皮下肿瘤结节平均重1.26±0.4 g,较对照组(3.14±0.56 g)明显减轻(P<0.05);当效靶比为200:1时,免疫组脾细胞杀伤活性为49.25±11.25%,显著高于对照组(18.50±9.95%,P<0.01)及荷瘤组(25.75±8.38%,P<0.01)。结论经肝素-琼脂糖亲和层析纯化的HAC70可通过诱导机体产生特异性杀伤艾氏腹水瘤细胞的活性,明显抑制荷瘤小鼠艾氏腹水瘤的生长。     

调节性T 细胞在糖尿病中的免疫保护作用及治疗进展

调节性T 细胞(regulatory T cells,Tregs)为一类特殊的T 淋 巴细胞亚群,因能够有效抑制自体免疫活性、预防人类的自体免 疫性疾病而受到广泛关注.Tregs 通过对其他免疫细胞的负调 节发挥维持免疫稳态的作用.已知Tregs 主要分为两类,天然的 Tregs(nTregs)以及外周抗原诱导的Tregs(iTregs).nTreg 是源自 胸腺的CD4 +CD25 +T 细胞,大约占外周CD4+T 细胞的5% ～ 10%[1] ,主要通过细胞间相互接触发挥免疫调节作用.iTregs 为 外周CD4 +CD25 -Treg 细胞由小剂量抗原或免疫抑制性细胞因 子诱导而成,是具有免疫活性的Foxp3+iTregs[2] ,包括Tr1、Th3 等细胞,主要通过分泌IL-10 和TGF-β发挥免疫负调控作用.     

维生素C与维生素E的联合免疫调节及抗氧化作用

目的:观察维生素C和维生素E联合应用对小鼠免疫功能及抗氧化功能的调节作用。方法:实验主要于2004-04/2005-10在承德医学院附属医院中心实验室完成,部分实验在日本千叶大学完成。选择雌性清洁级BALB/c小鼠60只,按随机数字表法分成6组,每组10只。分别为:①正常对照组:每天灌胃生理盐水0.3mL。②联合维生素组:每天灌胃0.3mL生理盐水内含维生素E0.3mg、维生素C1.5mg。③免疫抑制组:小鼠每5d腹腔注射环磷酰胺0.6mg(30mg/kg),共4次,制备免疫功能低下模型。④免疫抑制 维生素C组:每天灌胃0.3mL生理盐水内含维生素C1.5mg。⑤免疫抑制 维生素E组:每天灌胃0.3mL生理盐水内含维生素E0.3mg。⑥免疫抑制 联合维生素组:每天灌胃0.3mL生理盐水内含维生素E0.3mg、维生素C1.5mg。后4组小鼠均制备免疫功能低下模型,方法同免疫抑制组。连续给药20d后,麻醉小鼠断尾取血,处死后取其脾脏、肝脏及肌肉。通过测定小鼠刀豆蛋白A刺激淋巴细胞转化功能(计算刺激指数,刺激指数与淋巴细胞转化能力成正比)、脾细胞产生白细胞介素2的反应活性、天然杀伤细胞活性(酶标仪490nm处测定吸光度值(A),杀伤活性=(A实验组-A总自然释放)/(A正常对照组-A总自然释放)×100%)、血清及肝组织中脂质过氧化物含量、肝脏超氧化物超氧化物活性等指标,评估小鼠免疫功能和抗氧化功能的变化情况。结果:实验过程中免疫抑制组有1只小鼠在给药第17天死亡。①各组小鼠淋巴细胞刺激指数比较:免疫抑制组显著低于正常对照组(59.2%,100%,P<0.01),免疫抑制 联合维生素组显著高于免疫抑制组(105.2%,P<0.01)。②各组小鼠天然杀伤细胞活性比较:免疫抑制 联合维生素组小鼠的天然杀伤细胞活性显著高于免疫抑制组(P<0.01)。③各组小鼠白细胞介素2生成率比较:免疫抑制 维生素E组及免疫抑制 联合维生素组均显著高于免疫抑制组(P<0.01)。④各组小鼠血清及肝组织中脂质过氧化物含量、肝脏超氧化物歧化酶活性比较:免疫抑制组小鼠的血清、肝脏脂质过氧化物含量显著高于正常对照组(P<0.01),而免疫抑制 联合维生素组显著低于免疫抑制组(P<0.01)。免疫抑制组小鼠的肝脏超氧化物歧化酶活性显著低于正常对照组(P<0.01),而免疫抑制 联合维生素组显著高于免疫抑制组(P<0.01)。结论:维生素C和维生素E联用可提高小鼠的免疫功能及抗氧化能力。     

急慢性淋巴细胞白血病免疫表型分析

目的 探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞免疫表型差异。方法 应用ABCAP免疫组织化学方法，选用一系列的淋巴细胞相关抗原的单抗对169例初发ALL与38例CLL患者进行淋巴细胞表面抗原检测。结果 B-ALL患者白血病细胞的CDl9、HLA-DR阳性率较高，T-ALL患者的白血病细胞以CD7、CD5与CD3阳性率较高，CLL患者的白血病细胞除了以CDl9、CD20、CD22阳性率较高外，CD5也有明显表达。结论 对淋巴细胞白血病患者进行免疫表型分析，对于区别细胞类型，鉴别诊断有重要意义，为临床治疗提供依据。     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的:制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体,并对其生物学活性进行鉴定。方法:实验于2003-02/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联,透析除去未结合的多肽,与等体积的弗氏佐剂混匀后于0,2,4,6,8周对大鼠进行免疫处理,4只/次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度,α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg/L,血清稀释度从1∶40开始倍比稀释,辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1∶2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定,比值≥2.1为阳性。免疫结束后采血,离心取上清,与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50%,于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原,采用免疫亲和层析的方法,纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体,用Bradford对抗体进行定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度,以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析,用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。结果:实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度:抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生,8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性:抗体浓度为0.1g/L时滴度约1∶2560,并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体,具有较好的反应原性。③纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性:抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度,高达(139.6±15.5)%。该抗体的作用可被Prazosin阻断,降至(28.9±12.64)%,具有特异性及激动样活性。结论:采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

CpG岛甲基化异常的致癌作用

真核生物染色体DNA甲基化(DNA methylation)是基因表达调控的方式之一.DNA复制后,由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)催化S-腺苷蛋氨酸的甲基转移到DNA分子中形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine),从而生成甲基化DNA.高等真核细胞通常是对DNA分子上5′-CpG-3′序列的胞嘧啶进行甲基化修饰.CpG二核苷酸在人类基因组中占10%,其中70%～80%呈甲基化状态,可称为甲基化CpG位点.非甲基化CpG二核苷酸区域仅占基因组的1%～2%,这些CpG二核苷酸以较大密度分布于基因5′端,称为CpG岛.CpG岛一般为0.5～2 Kb长,通常位于基因的5′端启动区,也可延伸至基因的外显子区[1].