鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备

肌球蛋白重链(MyHC)是肌肉中的主要结构和功能蛋白,在肌肉收缩过程中起关键作用.根据鳜鱼肌球蛋白重链基因中高亲水性区域DNA设计一对特异性引物,将该基因片段亚克隆到pET-32a质粒,构建重组表达载体并转化入大肠杆菌BL21中.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.8 mmol/L IPTG诱导3 h可大量表达融合蛋白.将经亲和层析纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.ELISA和免疫组化测试结果表明:此抗体有较好的特异性和抗原性.鳜鱼MyHC基因表达的研究为深入研究肌球蛋白重链的功能特性及其对肉质性状的影响奠定基础,为提高鱼类肉质提供理论基础和技术支持.     

锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性比较

为研究锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性,采用qRT-PCR技术进行实时荧光定量分析,并用Ge Norm和Norm Finder软件对5个内参基因(RPL13,GAPDH,18 S rRNA,β-actin和RPS29)进行稳定性评估,筛选出不同组织中最适合的内参基因,以准确定量Clock基因的相对表达水平.实验结果表明,5个内参基因中,18 S rRNA在锦鲫的肌肉、心脏、肝脏中表达最稳定,β-actin在肠中表达最稳定,RPL13在肾中表达最稳定;根据筛选的内参基因定量Clock基因的相对表达水平发现,Clock基因在锦鲫肌肉中相对表达量最高,其次依次是肝脏、肾、肠,心脏中最低.本研究准确定量Clock基因,为锦鲫生物钟节律机制的下一步研究奠定了理论基础.     

海洛因对小脑皮质C-FOS表达的影响

为探索海洛因对小脑皮质C-FOS表达的影响,通过肌肉注射海洛因建立成瘾大鼠模型,用免疫组化方法检测小脑细胞C-FOS的表达.结果表明,大鼠连续注射7 d后,出现明显的戒断症状;小脑细胞中C-FOS表达阳性细胞数比对照组明显增多,与对照组相比有显著性差异（P〈0.01）.证明海洛因具有诱导C-FOS基因表达、损伤脑组织细胞的作用.     

利索卡因在SC CO2中的溶解度测定及模型研究

化合物在超临界CO2中的溶解度数据对选用合适的超临界流体法制备超细药物粒子非常重要,如对利索卡因的微粉化.为此,测定了不同条件下利索卡因在超临界CO2中的溶解度.实验结果表明:利索卡因在超临界CO2中的溶解度随压力(9.0～30.0 MPa)的升高而增大,随温度(308.0～328.0 K)的升高而减小,其溶解度主要受超临界流体密度的影响.采用不同模型对利索卡因的溶解度进行模拟预测,结果表明Chrastil经验模型比Peng-Robinson EOS模型和Mendez-Santiago and Tej经验模型有更好的关联效果,其平均相对偏差(AARD)为5.96％.     

Erastin对肺癌细胞MACC1基因表达的影响

利用不同浓度的Erastin处理人肺癌A549和A549/DDP细胞,以探究其对MACC1基因表达的影响.采用qRT-PCR,Western Blot检测MACC1 mRNA和蛋白在A549,A549/DDP细胞中表达的差异性,以及不同浓度的Erastin对MACC1基因表达的影响.结果表明,不同浓度的Erastin处理人肺癌A549和A549/DDP细胞48 h后,2种细胞的生长均被明显抑制,与对照组相比终浓度为5,40μmol/L的Erastin处理组其MACC1 mRNA和蛋白表达水平显著降低.在0～40 mg/L终浓度范围内,Erastin能显著降低A549/DDP细胞内MACC1 mRNA和蛋白的表达.     

酵母菌发酵人参药渣产物对肠道黏膜损伤小鼠肠道IgA分泌的影响

将40只BALB/c小鼠随机分成4组,阴性对照组、阳性对照组、发酵后的人参药渣组和模型组.利用环磷酰胺腹腔注射方法构建小鼠的肠道黏膜损伤模型.饲喂一周后,记录各组小鼠体重变化情况,酶联免疫法(ELISA)检测肠黏膜SIg A、免疫印迹法(Western blotting)检测小肠Ig A的蛋白表达量.结果表明:发酵药渣组的小鼠料重比相对阴性性对照组显著降低(P0.05),相对与模型组略低;发酵药渣可以显著促进肠道SIg A的分泌且Ig A蛋白表达量增加;药渣发酵后对可改善环磷酰胺诱导的小鼠肠黏膜损伤,并具有提高免疫能力的作用.     

高脂对中华鳖肝脏组织中microRNA及相关基因表达的影响

为研究高脂对中华鳖肝脏组织中micro RNA及相关基因表达的影响,选取180只中华鳖随机分成两个实验组,分别投喂脂肪质量分数为7.98%(对照组)和13.86%(高脂日粮组)的饲料.定制光周期为12 h光照vs12 h黑暗.饲养6周后,每间隔3 h采集一次肝脏样品,研究高脂对中华鳖micro RNA及相关基因节律性表达的影响.结果表明,中华鳖肝脏组织中3个重要的micro RNA均具有节律性表达特征,且与生物钟核心基因(Clock,Bmal1和Bmal2)和脂肪代谢基因(Lxrα,PPARα和Sirt1)之间具有较强的相关关系.但高脂日粮改变了mi R-1a,mi R-21和mi R-34a节律性表达特征和表达水平,从而引起其相应靶基因(生物钟核心基因和脂肪代谢基因)的昼夜节律表达模式、m RNA表达水平及他们之间的相关关系发生相应改变.该结果为micro RNA参与调控中华鳖肝脏中脂肪代谢相关基因的节律表达提供新视角.     

Ca~(2+)/CaM/CaMK调控热应激诱导小鼠胚胎成纤维细胞HSP72的表达

细胞受应激后合成HSP72以保护细胞免受损伤,热应激时Ca~(2+)/CaM和HSP72的表达高度相关,但Ca~(2+)/CaM是否调节HSP72表达及其机制尚不清楚。本研究将从12.5日龄胚胎获得的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)于39℃下进行热休克处理,并分别置于含CaCl_2、EGTA、W7和MyrAIP培养基中处理。分别采用RT-PCR和Western-Blot检测相关基因和蛋白表达。结果显示,在39℃热应激时,CaCl_2显著提高了细胞HSP72和CaM的表达,而EGTA和W7则显著降低了细胞HSP72和CaM的表达。同时,热应激上调了热激转录因子1(HSF1)、p-HSF1及HSP70蛋白的表达。然而,Myr-AIP显著抑制了细胞HSP72和p-HSF1蛋白的表达,而不影响HSF1蛋白的表达。这表明,热应激时,Ca~(2+)/CaM可通过活化CaMKⅡ诱导体外培养的MEFs细胞HSP72的表达。     

GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱

为了深入研究GAS41在胚胎发育中的作用机理,应用生物信息学软件分析了斑马鱼GAS41基因的序列特征;采用RT-PCR、整体原位杂交和整体免疫组织化学方法检测其在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱.结果显示斑马鱼GAS41蛋白与人类、小鼠、大鼠同源蛋白都有91.2％的同源性,具有高度的保守性.RT-PCR结果表明GAS41在检测的成体组织中均有表达,表达丰度相当.而GAS41在胚胎受精后一直持续表达,其中受精4h后表达量升高.整体原位杂交和免疫化学结果显示GAS41特异性表达于胚胎头部,尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显.这些都提示GAS41是一个高度保守基因,在斑马鱼中枢神经系统发育过程中可能起重要作用,同时也为GAS41在胚胎发育调控中的作用机制提供实验基础.     

甲基绿对水丝蚓超氧化物歧化酶活性的影响

采用急性毒性实验方法研究了不同浓度的甲基绿溶液对水丝蚓急性毒性(LC50),测定了经甲基绿胁迫后水丝蚓超氧化物歧化酶(SOD)的变化.结果表明:(1)甲基绿对水丝蚓24、48、72 h LC50分别为37.6、31.6、29.3 mg/L.(2)24 h实验,28、32、35 mg/L甲基绿溶液对水丝蚓SOD起诱导作用,与对照组比较,32、35 mg/L SOD活性升高,变化显著(P<0.05);40、45、50 mg/L高浓度试液对水丝蚓SOD起抑制作用,与对照组比较,45、50 mg/L动物SOD活性降低,变化显著(P<0.05);(3)48 h实验,28、32、35 mg/L甲基绿溶液对水丝蚓SOD起诱导作用,与对照组相比较,SOD活性升高,变化显著(P<0.05);40、45、50 mg/L高浓度试液对动物SOD起抑制作用,与对照组比较,SOD活性降低,变化显著(P<0.05);(4)72 h实验,水丝蚓SOD活性总体呈下降趋势.其中28 mg/L药剂对动物SOD活性与24 h相比有所升高.作为核染色剂的甲基绿溶液在一定浓度范围内对水丝蚓造成胁迫,影响动物正常行为及生理现象以至危害生命.     

鳜肌球蛋白轻链2基因cDNA的克隆及其发育表达分析

通过构建肌肉组织cDNA文库分离到鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2),基因登录号为FJ428249.MLC2基因cDNA序列全长1 206 bp,编码区长度为579 bp.MLC2基因开放阅读框编码170个氨基酸,具有EF-手相家族蛋白全部4个EF-手相结构.与已报道的其他动物MLC2相比较,所推导氨基酸序列同源性在66.3%～97.6%,其中与ca2+结合区域非常保守,7种鱼氨基酸序列同源性为100%.采用实时荧光定量PCR方法对鳜MLC2发育表达分析表明,MLC2在原肠期开始有低量表达,与原肠期相比,尾芽期、肌肉效应期和仔鱼阶段MLC2表达量随发育阶段渐进而升高.     

白头翁汤调控溃疡性结肠炎NKT细胞表达转录因子IL-13的信号通路的作用研究

初步探究白头翁汤调控溃疡性结肠炎(UC)NKT细胞表达转录因子白细胞介素-13(IL-13)的信号通路和转录因子的作用机制.实验采用白头翁汤灌胃对C57BL/6小鼠噁唑酮结肠炎模型进行治疗.根据小鼠疾病活动指数DAI、组织病理学判断白头翁汤及其阳性对照美沙拉嗪的疗效.采用HE染色观察白头翁汤对结肠黏膜NKT细胞浸润的影响,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测组织中IL-13的mRNA表达水平和mRNA浓度,采用West-ern blot方法检测白头翁汤对结肠黏膜NKT细胞表达转录因子IL-13的信号通路和转录因子以及对结肠上皮屏障的影响.结果显示:小鼠噁唑酮结肠炎模型构建成功后,小鼠体重出现明显的下降,DAI评分升高,经白头翁汤治疗后,小鼠体重下降减缓,并且小鼠的DAI评分降低(P<0.05);另外,白头翁汤改善了小鼠噁唑酮结肠炎模型的病理结构变化,组织损伤程度明显降低.Western blot检测发现,白头翁汤导致IL-13信号通路相关蛋白表达呈现不同程度的升高和降低,并且也改变了结肠上皮组织细胞连接蛋白的表达.HE结果印证相关蛋白表达的变化改善了结肠组织的病理结构.研究表明白头翁汤可能是通过降低溃疡性结肠炎NKT细胞表达转录因子IL-13来提高小鼠UC治疗效果,初步机制可能是激活了IL-13相关通路蛋白和结肠上皮细胞连接蛋白的表达.     

Cu2+对中国林蛙蝌蚪生长发育的毒性效应

采用标准水生生物毒性测定方法研究了Cu^2＋对中国林蛙蝌蚪的毒性效应.急性毒性实验结果表明,在水温22～24℃条件下,Cu^2＋对中国林蛙蝌蚪24、48、72h的半致死浓度（LC50）和安全浓度（SC）分别为0.131、0.105、0.038和0.02mg/L,并且蝌蚪的死亡率随着Cu^2＋浓度的升高和染Cu^2＋时间的延长而增大.亚急性毒性实验结果表明在安全浓度下,Cu^2＋污染仍可抑制中国林蛙蝌蚪的生长发育,并对中国林蛙蝌蚪产生致畸效应.     

CRISPR/Cas9系统对斑马鱼fhl1a基因敲除有效性的研究

为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现对目的靶基因fhl1a的敲除.随后收集部分72 h胚胎进行PCR检测和产物直接测序,确定有无突变.为进一步验证突变是否可稳定遗传,选择具有敲除了的F_0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F_1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析.结果显示F_1获得了不同程度的插入、缺失等突变类型.研究结果证明所设计的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系统能在斑马鱼体内有效地形成基因突变,该突变能稳定地遗传到下一代个体,这为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下了基础.     

人角质细胞生长因子-1在水稻中的表达

人角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor,KGF）在组织的损伤修复中起着重要的作用.植物细胞生物反应器是一种成本低、安全性好的蛋白生产系统.本研究将人KGF-1经农杆菌介导法转入水稻中,共获得38株抗性再生植株.Southern杂交和RT-PCR结果表明KGF-1基因整合入水稻基因组中且部分转化株中KGF-1基因得到转录.Western blotting检测结果显示有两株转化水稻中能够表达KGF-1.     

IPTG诱导浓度、时间及温度对重组鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因表达的影响

以重组鲑鱼降钙素与降钙素基因相关肽融合基因pGEX(CGRP/msCT)的工程菌为研究对象,利用IPTG作为诱导剂,分析比较在不同IPTG诱导条件下融合基因表达的效果,确定最佳IPTG诱导条件。结果表明∶在IPTG终浓度为0.2 mmol.L-1,诱导温度为37℃,诱导时间为5 h的条件下,该融合蛋白的表达量最大。利用光密度扫描对表达产物进行初步定量的结果表明,目的蛋白约占菌体总蛋白的32.11%。     

水解酸化-MBBR处理乳品废水的工艺优化实验研究

采用水解酸化-MBBR工艺对乳品废水进行处理,通过工艺优化得出乳品废水处理的最优运行参数。主要考察曝气量、硝化液回流比、污泥回流比对废水中COD和氨氮去除效果的影响。实验结果表明,水力停留时间为10 h,曝气量在0. 2～1. 0 L·min~(-1)范围内,COD去除率达到最大值93. 9%,所需曝气量为0. 8 L·min~(-1)。而氨氮的去除率在曝气量为0. 8 L·min~(-1)时达到最大值81. 4%。将硝化液回流比的变化控制在100%～300%内,当硝化液回流比升高到200%时,COD的去除率达到最大值92. 4%。当硝化液回流比继续上升到250%时,氨氮去除率达到最高值82. 8%。硝化液回流比由200%上升到250%过程中,氨氮去除效果增幅不明显,所以硝化液回流比的最佳值为200%。污泥回流比在50%～250%变化时,在150%时对COD和氨氮的去除率分别达到最大值91. 9%和84. 6%,确定最佳回流比为150%。由此可以看出水解酸化-MBBR处理乳品废水有着一定的优势。     

姜黄素对实验动物肿瘤的抑制作用

姜黄素具有降血脂、抗血小板及清除氧自由基 ,提高网状系统吞噬力 ,调节机体免疫力等作用 .其中抗肿瘤作用是姜黄素的主要活性之一 .将B1 6细胞于体外Cur处理 48h ,接种于小鼠皮下 .观察其成瘤性的变化 .取 1× 1 0 5 个同上预处理的B1 6活细胞 ,给小鼠尾静脉注射 ,与对照组比较肺转移瘤数 ,并计算肺转移抑制率 .从实验结果看 :低浓度Cur预处理B1 6细胞 ,不仅可使其成瘤能力明显下降 ,且侵袭转移能力也有一定程度的下降 .     

重金属镉对鲫鱼毒性效应的研究

采用常温静水实验法,探讨重金属污染物镉(Cd)对鲫鱼的急性毒性效应。通过对(150±10)g的鲫鱼进行的重金属镉染毒实验得出,其在24、48、72和96 h对重金属镉半致死浓度(LC50)和绝对致死浓度(LC100)分别为57.375、23.558、18.216、16.920 mg·L-1以及101.415、47.236、39.475、35.738 mg·L-1。利用微波消解-电感耦合等离子体质谱法分析测定鲫鱼组织中重金属镉的富集含量和消除规律:镉在鲫鱼不同组织内的富集程度不同,肌肉中最大富集浓度为2.069 5 mg·L-1,而内脏和鳃的最大富集浓度分别为27.484和45.252 mg·L-1,远远高于肌肉对镉的富集,即鳃内脏肌肉。而且高浓度的重金属镉在鲫鱼体内消除比低浓度的要快,在不同组织中的消除情况表现为鳃内脏肌肉。以上研究结果表明,鲫鱼对不同时间段和不同浓度的重金属镉的毒性表现出不同的耐受能力;重金属镉在鲫鱼不同组织内的富集含量也不同;鲫鱼具有自身调控机制,在耐受范围内能将镉排出体外。     

靶向CK1α基因shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

通过RNA干扰实验沉默酪蛋白激酶1α(Casein Kinase 1,CK1α)基因,探讨其对肺癌细胞A549生长增殖的影响.首先构建3个针对CK1α基因不同位点的短发夹表达载体pGenesil-CK1α-S1、pGenesil-CK1α-S2、pGen-esil-CK1α-S3和一个无义错配载体pGenesil-NK,分别转染A549细胞,用G418筛选出阳性克隆,得到A549-S1、A549-S2、A549-S3及A549-NK细胞株.再通过RT-PCR和Western blotting方法,分别检测了CK1α基因的mRNA和蛋白的表达情况.比对A549-NK,A549-S1、A549-S2及A549-S3 mRNA水平的抑制率分别为84.3%、57.9%和61.8%(P<0.001);蛋白质水平的抑制率分别为78.4%、51.3%和59.9%(P<0.001).选择干扰效率较好的A549-S1细胞进行后续实验.细胞计数绘制生长曲线、CCK-8法观察细胞增殖状况和流式细胞仪检测细胞所处周期时相来分析转染CK1α基因shRNA表达载体对A549细胞生长增殖的影响.实验结果显示,A549-S1与A549和A549-NK两对照组的平均值比较,细胞计数抑制率为(37.7±2.2)%(P<0.01);CCK-8抑制率为(26.2±1.5)%(P<0.05);S期减少(75.0±4.0)%(P<0.01);G2/M期减少(45.2±5.4)%(P<0.05).因此,转染CK1α基因shRNA表达载体可导致CK1α基因的沉默,明显抑制A549细胞的生长和增殖.