M3R介导逼尿肌细胞收缩与信使分子IP3关系的实验研究

目的 :探讨信使分子IP3 在M3 R介导逼尿肌细胞收缩中的作用。方法 :MR非选择性的激动剂 (carba chol)、拮抗剂 (atropine)及M2 R拮抗剂 (methoctramine)、M3 R拮抗剂 (4-DAMP)刺激原代培养人逼尿肌细胞 ,通过 [3 H]掺入法 ,检测磷脂酰肌醇 (PI)的代谢产物 [3 H]-IP含量。结果 :[3 H]-IP的含量随carbachol刺激浓度的增加而增加 ;atropine和 4 -DAMP能显著抑制carbachol诱导的代谢反应 (P <0 .0 1) ,而methoc tramine不能显著抑制carbachol的作用 ;atropine与 4 -DAMP的作用相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :M3 R与PI分解产生的第二信使分子IP3 密切相关。     

Relationship between PI decomposition and M3R expression in human cultured detrusor muscle cells

Objective: To study the relationship between the expression of muscarinic receptor subtype M_3R and thedecomposition of phosphatidylinositol(PI). Methods: The[~3H]-IP contents were detected with[~3H]incorporationin human cultured detrusor muscle cells after being stimulated by carbachol, atropine, methoctramine, and 4-DAMP,respectively. Results: The [~3H]-IP contents m increased with the elevation of carbachol concentration. Both atro-pine and 4-DAMP significantly inhibited the effect of carbachol on PI decomposition (P<0.01), but methoctramine     

Ca2+-CaM在M3R介导逼尿肌细胞收缩中作用的实验研究

目的探讨Ca2+-CaM在M3R介导逼尿肌细胞收缩中作用.方法将原代培养逼尿肌细胞分为实验组和对照组,接种于6孔培养板上培养,加入10-4mol/L carbachol 和methoctramine ,采用Ca2+浓度和CaM活性检测试剂盒分别测定Ca2+浓度和CaM活性.结果实验组中,[Ca2+]i和CaM的平均通道荧光对数值分别为(3.26±0.38)和(2.87±0.34),与对照组[分别为(2.06±0.12)、(2.14±0.24)]相比,均有显著性的升高(P<0.05).结论 Ca2+-CaM信号传导途径参与了M3R介导逼尿肌细胞收缩调节过程.     

硝普钠对大鼠肾组织块细胞增生及蛋白合成的双向性作用以及环鸟核苷酸环化酶特异性抑制剂ODQ对其影响

目的,探讨一氧化氮（NO）对孵育的肾组织块细胞增生和蛋白合成的影响。方法：取正常Wistar大鼠肾组织块40－70mg,置于Krebs-Henseleit溶液中,放入37度恒温并带有摇床（频率100次／分）的孵 箱中孵育2h,孵育液中持续通入混合氧（O2：CO2＝95：5）,细胞增生和蛋白合成分别采用[^3H]－胸腺嘧啶和[^14]－亮氨酸掺入法测定。结果：本研究结果显示,低浓度硝普钠（SNP,0．5umol.L^-1)分别引起[^3H]－胸腺嘧啶和[^14C]－亮氨酸掺入增加（P＜0．01）,而高浓度SNP（50－500umol.L^-1)显著抑制[^3H]－胸腺嘧啶和[^14C]－亮氨酸掺入（P＜0．01）ODQ（1－H－[1,2,4]oxadiazolo[4,3-1]quinoxalin-1-one)可显著防止SNP对[^3H]-胸腺嘧啶和[^14H]－亮氨酸掺入的刺激作用（P＜0．01）,而对高浓度SNP所导致的[^3H]胸腺[嘧啶和－[^14C]－亮氨酸掺入抑制作用无影响。结论：本研究结果提示NO对肾脏细胞增生和蛋白合成有双向性调节作用,其刺激作用可能由cGMP介导。     

P物质对培养的大鼠垂体前叶细胞IP3含量影响的研究

目的：探讨SP对大鼠AP培养细胞中IP3的水平是否有影响，进一步阐述SP产生生物学效应的机制。方法：原代培养成年雌性S－D大鼠AP细胞48h，[^3H]-肌醇标记36h，加入不同浓度的SP孵育30min，超声震碎细胞，用AG1－X8阴离子交换层析树脂提取分离[^3H]-IP,应用液闪测定样本计数率（cpm)。结果：孵育时间为30min时，SP以浓度依赖的方式使AP细胞内IP3的水平增加。结论：兴奋AP细胞SPR后的生物学效应至少有一部分是通过第二信使IP3来完成的，在信息转导途径上为SP对生殖轴调控的理论进行进一步证明和补充。     

M受体及其亚型与逼尿肌功能的关系研究

目的 探讨M受体亚型与逼尿肌功能变化之间的关系。方法 根据膀胱压力容积测定结果将动物分为稳定组和大稳定组，通过体外肌条拉力试验记录不同M受体及其受体活性药物作用下逼尿肌肌条自发性收缩频率及收缩力变化。结果 正常大鼠中逼尿肌不稳定发生率为25.6%。在一定张力下逼尿肌有自发性收缩产生。不稳定组体外肌条自发性收缩频率及收缩力较稳定组笱高，阿托品、4－DAMP和Methoctramin对肌条自发性收缩频率无影响，卡巴可能使自发性收缩频率和收缩力增加，阿托品和4－DAMP可部分抑制这种作用，Methoctramin作用不明显。结论 逼尿肌自律性不依赖M受体及其亚型，肌源性因素是逼尿肌不稳定产生的重要原因，M3受体亚型能进一步增加逼尿肌自律性和收缩力。     

M_3受体激动对心肌细胞保护作用的实验研究

目的探讨M3受体激动对H2O2诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡的作用及其机制。方法以H2O2诱导大鼠培养心肌细胞损伤模型为基础,给予M3受体激动剂胆碱和M3受体阻断剂4DAMP进行干预。流式细胞仪行细胞凋亡检测;逆转录-聚合酶链反应检测凋亡抑制蛋白Bcl-2。结果胆碱可显著降低H2O2对心肌细胞的损伤,提高心肌细胞存活率,并降低细胞的凋亡率;胆碱可增加凋亡心肌细胞Bcl-2的表达;M3受体阻断剂4DAMP可逆转胆碱的上述作用(P<0.01)。结论激动M3受体对H2O2诱导的心肌细胞凋亡有保护作用,其机制可能与凋亡抑制蛋白Bcl-2有关。     

M3受体激动对心肌细胞损伤的保护作用

目的探讨激动M3受体对心肌细胞损伤的保护作用.方法以H2O2诱导大鼠培养心肌细胞损伤模型为基础,给予M3受体激动剂胆碱和M3受体阻断剂4DAMP进行干预.末端标记法(TUNEL)行细胞凋亡检测;Western Blot蛋白印迹检测凋亡抑制蛋白Bcl-2.结果①胆碱可显著降低H2O2对心肌细胞的损伤,提高心肌细胞存活率,并降低细胞的凋亡率;②胆碱可增加凋亡心肌细胞Bcl-2的表达;③M3受体阻断剂4DAMP可逆转胆碱的上述作用(P<0.01).结论 M3受体激动对H2O2诱导的心肌细胞损伤有保护作用.     

丹红注射液通过改善线粒体功能障碍减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

[目的]研究丹红注射液(DHI)对缺氧/复氧(H/R)损伤心肌细胞线粒体功能的调节作用机制。[方法]建立原代心肌细胞H/R损伤模型。四甲基噻唑蓝(MTT)法检测磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)/MAPK激酶(MEK)抑制剂LY294002与PD98059干预后,DHI对H/R损伤心肌细胞存活的影响。采用荧光探针Rh123检测DHI对H/R损伤心肌细胞线粒体膜电位(Δφm)的影响。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测LY294002和PD98059干预后DHI对H/R损伤的心肌细胞PI3K及MEK下游丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)和ERK1/2蛋白表达及活性水平的影响。应用海马生物能量检测仪测定正常与H/R损伤条件下DHI对线粒体能量代谢的影响。[结果] DHI能够明显逆转H/R引起的细胞活力和线粒体膜电位下降。阻断剂LY294002和PD98059干预后,DHI对心肌细胞活力和线粒体膜电位的改善作用明显减弱。DHI能够显著增加H/R损伤的心肌细胞Akt和ERK蛋白磷酸化水平,且这种促进作用能够被抑制剂LY294002和PD98059抑制。常氧条件下,DHI不影响心肌细胞线粒体能量代谢。H/R条件下,DHI能够显著抑制心肌细胞线粒体基础耗氧率与最大耗氧率下降,增加线粒体能量储备能力。[结论] DHI能够激活Akt和ERK1/2,抑制H/R造成的线粒体能量代谢障碍,维持线粒体储备能力,缓解H/R诱导的心肌细胞损伤。     

钙信号在周期性牵张诱导逼尿肌细胞高表达Cx43中作用的实验研究

目的探讨钙信号在周期性牵张诱导膀胱逼尿肌细胞高表达连接蛋白43(Connexin43,Cx43)中的作用.方法运用牵张膀胱逼尿肌细胞体外模型,给逼尿肌细胞周期性20%牵张持续6 h,采用RT-PCR测定受EGTA孵浴的逼尿肌细胞Cx43 mRNA表达改变;采用激光共聚焦法,测定不同钙通道拮抗剂作用条件下,细胞内游离钙离子浓度([Ca2 ]i)的改变.结果牵张前30 min培养基中加入5 mmol/L EGTA,可以显著抑制牵张诱导的Cx43 mRNA高表达;机械牵张可以显著增加[Ca2 ]i;5 mmol/L EGTA可以完全抑制牵张诱导的[Ca2 ]i增加;GdCl3、硝苯地平、兰尼碱与毒胡萝卜素可分别抑制61.95%、29.98%、87.98%由牵张诱导的[Ca2 ]i增加.结论牵张诱导Ca2 内流及通过Ca2 内流诱导的钙触发钙释放(calcium-induced Ca2 release,CICR),在牵张诱导的逼尿肌细胞Cx43高表达反应中可能起着重要的作用.     

三磷酸肌醇变化与逼尿肌不稳定关系的研究

【目的】探讨大鼠逼尿肌组织三磷酸肌醇[Inositol（1,4,5）-trisphosphate,IP门变化与逼尿肌不稳定（Detrusorinstabilitv,DI）的关系。【方法】建立DI大鼠模型,分别检测DI大鼠,逼尿肌稳定（detrusorstability,DS）大鼠及经卡巴可（Carbach01）处理的Ds大鼠逼尿肌原代培养细胞IP,含量。应用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测DI及DS大鼠逼尿肌组织三磷酸肌醇受体（1nositol（1,4,5）-trisphosphatereceptor,IP3R）亚型变化。【结果】DI大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量显著高于Ds鼠（P〈0．01）,经105 mmolflcarbachol刺激后,DS大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量较刺激前显著升高（P〈0．01）。DS及DI大鼠膀胱逼尿肌组织均有IP3RI、Ⅱ、Ⅲ亚型表达,DI大鼠IP,RI、Ⅱ亚型表达显著高于DS大鼠（P〈0．05）,IP,RⅢ亚型表达差异无统计学意义（P〉0．05）。【结论】肌醇脂质信号传导通路可能参与了逼尿肌不稳定的形成,IP3含量的增高及IP3RI、Ⅱ亚型表达增强可能在其中起着重要作用。     

阿托品对人视网膜色素上皮细胞D407株 表达及分泌TGF β2的调控

目的：通过观察不同浓度阿托品联合10-5 mol/L卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌TGF β2的变化,探讨阿托品对RPE细胞表达及分泌TGF β2的调控作用。方法：常规培养D407细胞,药物干预前换用无血清培养基培养, 分为4组。（1）实验组（A组）：A1~A5组依次加入10-4～10-8 mol/L阿托品,孵育30 min后每组加入10-5 mol/L卡巴胆碱;（2）阴性对照组（B组）：B1~B5组依次加入10-4～10-8 mol/L阿托品;（3）阳性对照组（C组）：加入10-5 mol/L卡巴胆碱;（4）空白对照组（D组）：不加药物。干预24 h后采用RT PCR,Western印迹及ELISA法检测细胞胞浆中TGF β2 mRNA及蛋白质的表达水平及上清液中TGF β2的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果：实验组D407细胞胞浆TGF β2 mRNA和蛋白质表达水平及上清中TGF β2蛋白质含量均较阳性对照组低,10-4 mol/L阿托品可完全阻断10-5 mol/L卡巴胆碱上调TGF β2表达及分泌的作用,其效应具有浓度依赖性（F=1 056.897, 1 320.170, 475.657;P＜0.001）。阴性对照组D407细胞胞浆TGF β2 mRNA和蛋白质表达水平及上清中TGF β2蛋白质含量与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：阿托品可有效抑制卡巴胆碱促进人RPE细胞表达及分泌TGF β2的功能,提示M受体参与介导此过程。     

膀胱梗阻大鼠逼尿肌不稳定与三磷酸肌醇关系的实验研究

目的探讨膀胱梗阻大鼠逼尿肌不稳定(detrusor instability ,DI)与三磷酸肌醇[inositol(1,4,5)-trisphosphat ,IP3]含量变化的关系.方法建立DI大鼠模型,分别检测DI大鼠、逼尿肌稳定(detrusor stability, DS)大鼠及经卡巴可(Carbachol) 处理的DS大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量.结果DI大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量显著高于DS大鼠(P＜0.01),经10-5mmol/L卡巴可刺激后,DS 大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量较刺激前显著升高(P＜0.01).结论肌醇脂质信号传导通路可能参与了逼尿肌不稳定的形成,IP3含量的升高可能在其中起着重要作用.     

Involvement of M3 cholinergic receptor signal transduction pathway in regulation of the expression of chemokine MOB-1, MCP-1 genes in pancreatic acinar cells

Summary Whether M3 cholinergic receptor signal transduction pathway is involved in regulation of the activation of NF-κB and the expression of chemokine MOB-1, MCP-1 genes in pancreatic acinar cells was investigated. Rat pancreatic acinar cells were isolated, cultured and treated with carbachol, atropine and PDTCin vitro. The MOB-1 and MCP-1 mRNA expression was detected by using RT-PCR. The activation of NF-κB was monitored by using electrophoretic mobility shift assay. The results showed that as compared with control group, M3 cholinergic receptor agonist (10⁻³ mol/L, 10⁻⁴ mol/L carbachol) could induced a concentration-dependent and time-dependent increase in the expression of MOB-1, MCP-1 mRNA in pancreatic acinar cells. After treatment with 10⁻³ mol/L carbachol for 2 h, the expression of MOB-1, MCP-1 mRNA was strongest. The activity of NF-κB in pancreatic acinar cells was significantly increased (P<0.01) after treated with M3 cholinergic receptor agonist (10⁻³ mol/L carbachol)in vitro for 30 min. Either M3 cholinergic receptor antagonist (10⁻⁵) mol/L atropine) or NF-κB inhibitor 10⁻² mol/L PDTC) could obviously inhibit the activation of NF-κB and the chemokine MOB-1, MCP-1 mRNA expression induced by carbachol (P<0.05). This inhibitory effect was significantly increased by atropine plus PDTC (P<0.01). The results of these studies indicated that M3 cholinergic receptor signal transduction pathway was likely involved in regulation of the expression of chemokine MOB-1 and MCP-1 genes in pancreatic acinar cellsin vitro through the activation of NF-κB. ZHENG Hai, male, born in 1972, M. D., Ph. D.     

巴豆对大鼠膀胱逼尿肌肌条运动的影响

目的观察巴豆水煎剂对豚鼠离体膀胱通尿肌肌条运动的作用,并探讨其作用机理。方法将通尿肌肌条悬挂于离体平滑肌灌流肌槽内,采用累积加入巴豆水煎剂的方法,观察其影响。结果①巴豆增高豚鼠离体膀胱逼呆肌肌条的张力,并呈剂量依赖性关系（r＝0．80,P＜0．01）。②异搏定部分阻断巴豆增高肌条张力的效应（P＜0．001）。六烃季胺、阿托品、酚妥拉明和消炎痛均不阻断巴豆增高肌余张力的效应（P＞0．05）。结论巴豆剂量依赖性增高豚鼠离体膀胱通尿肌张力,其作用部分经由平滑肌细胞膜的Ca~(2+)通道。     

脑缺血时乙酰胆碱加强谷氨酸的神经兴奋毒性及受体机制研究

分别用ＴＴＣ染色和ＨＥ染色观察大鼠大脑中动脉闭塞后乙酰胆碱（ＡＣｈ） 和谷氨酸（Ｇｌｕ） 对梗塞面积及细胞形态的影响; 采用皮质脑电图记录方法, 观察大鼠双侧颈总动脉夹闭后, Ｇｌｕ、ＡＣｈ 及ＡＣｈ 受体激动剂、拮抗剂对脑电图恢复时间的影响。结果发现： Ｇｌｕ 可使梗塞面积扩大, ＡＣｈ 可使Ｇｌｕ 的这种效应放大３０％ （Ｐ＜ ０．０１）; 脑缺血后Ｇｌｕ 使缺血区细胞破坏加重,ＡＣｈ 可加剧细胞的崩解,Ｇｌｕ 致缺血性皮质神经元兴奋性存在量效关系,其阈值为１０－ ２ｍ ｏｌ／Ｌ, ＡＣｈ 可使之降为１０－ ３ ｍ ｏｌ／Ｌ, ＡＣｈ 的这种作用可被阿托品所阻断而不被六羟季胺拮抗, 可被氨甲酰胆碱呈浓度－ 效应模拟, 而不被烟碱模拟。可见, 脑缺血时, 乙酰胆碱通过Ｍ 型受体降低谷氨酸兴奋毒性的阈值而表现出加强谷氨酸的神经兴奋毒性作用。     

G蛋白β、γ亚基对M2受体的磷酸化的影响

目的：探讨G蛋白β、γ亚基在调节G蛋白偶联受体激酶活性的重要作用和G蛋白β、γ亚基影响M2受体磷酸化新的作用机制。方法：利用四个柱层析分离G蛋白α亚基与G蛋白β、γ亚基;将纯化的G蛋白β、γ亚基、GRK-2,[γ-P^32]标记的ATP与mAChR2,共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶片干燥后放射性自显影检测M2受体磷酸化结果。结果：G蛋白β、γ亚基在没有激动剂存在的情况下明显增强M2受体的磷酸化。氨甲酰胆碱明显增强M2受体的磷酸化,阿托品或肝素（GRK2抑制剂）完全阻断M2受体的磷酸化。M2受体的磷酸化是依赖激活剂如氨甲酰胆碱作用发生的,这种依赖关系呈明显的剂量关系。结论：G蛋白β、γ亚基是通过上调GRK2活性增强M2受体的磷酸化的。说明Gβγ同Gα一样均可引起效应蛋白的激活,在细胞信号转导中起同样重要作用,共同介导一系列的生物学效应。     

Cholinergic agonists increase intracellular calcium concentration in guinea pig vestibular hair cells

Objective To better understand the cholinergic receptors in vestibular hair cells (VHC) an d their subtypes, and to investigate the effects of cholinergic agonists on intr acellular calcium concentration (［Ca(2+)］(i) ) in guinea pig VHCs.Methods VHCs were isolated from guinea pig crista ampullaris by enzymatic and mechanical methods. The effect of cholinergic agonists on ［Ca(2+)］(i) was examined using laser scanning confocal microscopy and the Ca［2+］ sensitive dye Fluo -3.Results The results showed that the addition of acetylcholine (ACh) and carbachol (CCh), muscarnic and nicotinic agonists, induced ［Ca(2+)］(i) increases in all th e VHCs, whereas acetylcholine bromide (ACh-Br), a nicotinic agonist, induced th e ［Ca(2+)］(i) increase in only a small percentage of VHCs. The ACh or CC h-induced Ca［2+］ response could be partially suppressed by atropine. In th e presence of 0.1 mmol/L atropine, the amplitudes of ACh or CCh-induced ［Ca(2+)］(i) responses became significantly smaller than those in atropine free medium (P&lt;0.01). Conclusions The results suggest the existence of cholinergic receptors in guinea pig VHCs. It is the muscarnic agonists rather than nicontic receptors that dominate ［Ca(2+)］(i) variation. Atropine can suppress muscarnic agonist-induced Ca［2 +］ responses.