商品普鲁兰粗酶的分离纯化

对商品普鲁兰酶进行分离纯化。用已购得的商品普鲁兰酶,制成酶液,采用硫酸铵进行分级盐析,通过脱盐、离子交换层析和凝胶色谱,分离得到较纯的普鲁兰酶。通过SDS-PAGE电泳分析,获得了单一条带,表明所分离的酶已经达到电泳纯,该酶的分子量约为82kDa。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺能够促进酶的活性,其中Ca²⁺激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

Thermotoga maritima普鲁兰酶的基因克隆与酶学性质研究

以海栖热袍菌(Thermotoga mariti ma)MSB8基因组DNA为模板,PCR扩增出普鲁兰酶基因pulA,克隆入表达载体pET28a,转化EscherichiacoliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,测定普鲁兰酶酶活性。结果表明,重组转化子的细胞破碎液有普鲁兰酶活性,SDS-PAGE电泳结果显示出分子量约为96ku特异性蛋白质条带。酶学性质分析表明,其最适反应温度达到95℃,在30~80℃均保持最大酶活力的80%以上,最适反应pH值为6.0,且在碱性条件下稳定。     

解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

对来源于菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21的普鲁兰酶（命名为PulBa）分离纯化,研究其酶学特性,为普鲁兰酶在淀粉加工中的应用提供理论基础。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析从菌株HxP-21发酵液中分离纯化出一种新型的普鲁兰酶。酶的纯化倍数20.8,回收率53.2%,比活力176.5 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得PulBa达到电泳纯,分子质量51.2 kDa。PulBa在45～70 ℃和pH 3～6范围内具有较高酶活力,最适反应温度55 ℃、pH 4.5。PulBa有良好的pH值稳定性和热稳定性,40～70 ℃孵育120 min保留最初活性的80%以上;pH 3～7范围内具有很高的稳定性,孵育6 h后仍保留60 U/mL以上活性。PulBa对各种金属离子和化学试剂表现出不同的敏感性,Mg2＋和Ca2＋能够显著增强酶活力。PulBa最适作用底物为普鲁兰糖,对马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉和糖原也有一定水解活性,但对α-环糊精和β-环糊精和直链淀粉无活性。以普鲁兰糖为底物PulBa的Km和Vmax值分别为1.34 mg/mL和24.6 μmol/（min·mg）。研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶。薄层层析进一步证明,PulBa专一性水解支链淀粉α-1,6-糖苷键,产生麦芽三糖。本研究确定了一种新型的普鲁兰酶,该酶在高热稳定性和酸性环境下具有高活性,在淀粉加工等生物技术产业中有较好的应用潜力。     

耐热普鲁兰酶真菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

本研究从西藏羊八井热泉下游淤泥中筛选得到了一株高产耐热普鲁兰酶菌株YBJ10-2,经诱导后其最高产酶量可达55.732U/mL,是目前国内外发现的产酶量较高的真菌。根据形态特征及18S rDNA序列同源性分析,初步判定菌株YBJ10-2属于球孢枝孢菌。该菌株发酵所产耐热普鲁兰酶在65-75℃和pH 5.0-8.0条件下较稳定,最适pH值为6.5,最适温度为72℃,对普鲁兰糖和支链淀粉催化能力最强,具有广阔的开发应用前景。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

为考察嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)普鲁兰酶结构域B对热稳定性及其他酶学特性和功能的影响,采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶的结构域B置换为Geobacillus thermoleovorans普鲁兰酶结构域B。嵌合突变体在60℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min,解折叠一半时的温度由65℃提高至72℃,嵌合突变体较野生型具有更加优良的动力学稳定性和热动力学稳定性。结构域B置换后,最适pH碱向偏移至pH6.5,最适温度提高至70℃。比酶活及底物特异性实验结果显示,嵌合突变削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合,转而有利于与糊精及可溶性淀粉的结合。淀粉糖化结果显示,嵌合突变不影响突变体的实际应用性能。上述结果表明,B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著,可通过同源置换构建适合于不同淀粉糖化工艺的突变体。     

产普鲁兰酶蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用选择性培养基从广西南宁淀粉加工厂附近土壤中分离出一株具有产普鲁兰酶能力的野生菌株GXBC-2。该菌株革兰染色为阳性,形成芽孢,菌体细胞杆状,结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为Bacillus cereus GXBC-2。对该菌所产普鲁兰酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为50℃,在30～50℃范围内稳定,最适pH为7.0,稳定pH范围为6～8.5。产物经HPLC分析证明,该酶能水解普鲁兰糖产生麦芽三糖,对可溶性淀粉不起作用,所以该酶属于I型普鲁兰酶。     

一株产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定、酶学性质及海带多糖酶解产物的抗氧化活性

本研究从连云港海泥中筛选产普鲁兰酶菌株,利用形态学、生理生化特征、基因序列(16S rRNA和 gyrB)进行分析鉴定。利用产酶菌株发酵制备普鲁兰酶,初步纯化后分析其酶学性质。利用该普鲁兰酶粗提物对海带多糖进行水解,并对其水解产物进行抗氧化活性分析。结果表明:筛选得到一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium),经发酵纯化后普鲁兰酶比活力为62.3 U/mg,分子量约为43 kDa。该酶的最适反应温度为45 ℃,最适pH为6.5,在温度40 ℃下保温5 h,相对残余酶活达95%以上,而60 ℃下保温1 h,酶全部失活。在pH6~7.5之间保温12 h后,该酶仍有40%以上的相对残余酶活。DPPH和·OH自由基清除实验表明:海带多糖经普鲁兰酶水解后抗氧化活性显著增强(p<0.05),为普鲁兰酶在食品工业中的应用研究提供了新的方向。     

用普鲁兰酶改进淀粉膜质量的研究

普鲁兰酶可使淀粉中的支链淀粉脱支而形成直链淀粉,从而提高淀粉膜的成膜性能及强度。本文通过正交试验L16(45)研究了普鲁兰酶对玉米淀粉脱支时pH、时间、温度及酶浓度等参数对淀粉膜抗张强度的影响,得到了实验范围内的最佳工艺条件。      

采用复合保护剂提高重组普鲁兰酶稳定性

通过向重组普鲁兰酶(PUL)酶液中添加保护剂和防腐剂以提高其热稳定性及储存稳定性,在不同温度下研究了复合保护剂对酶液的热稳定性影响,并研究了保护剂和防腐剂在常温保藏下对酶液贮存稳定性的影响。结果表明,明胶、甘油、Tween20和Ca2+四种保护剂能显著提高PUL的热稳定性,并通过正交试验得到了效果最佳的复合保护剂配方,即Tween20 2 m L/L,明胶6 g/L,甘油5%,Ca2+0.1 mol/L。在60℃下,添加复合保护剂的PUL酶液保温1 h后的酶活保留率为96.07%,较对照高出85.29%;在55℃,通过添加复合保护剂,半衰期较对照提高了3.27倍。最终在常温保藏90 d后,含有复合保护剂和防腐剂(1 g/L山梨酸钾和1 g/L苯甲酸钠)的PUL酶活保留率高达85.25%,达到了工业保藏的需求。     

关中地区地下热泉普鲁兰酶产生菌的分离及其酶学性质

从关中地区的西安市区、临潼区、长安区,以及杨凌周边地区,分别采集地下热泉泉水水样,采用培养法分别得到105株普鲁兰酶产生菌,对其中21株进行16S r DNA基因片段序列分析。比对表明,克雷伯菌属(Klebsiella)和芽孢杆菌属(Bacillus)在热泉生态系统中处于优势地位。根据统计结果,所分离的菌株在种间和种内均有显著的酶活力差异。其中GP-1最适温度为50℃,最适p H 4.0,在50℃时有良好的稳定性,保温30 min仍有92%剩余酶活。     

用普鲁兰酶改进玉米淀粉基复合膜性能的研究

以玉米淀粉为原料,选用甘油为增塑剂,羧甲基纤维素钠与海藻酸钠复合为增强剂,采用延流法制备玉米淀粉基复合膜。研究增塑剂的种类、用量,增强剂的种类、用量,烘干温度,延流体积等对复合膜性能的影响。普鲁兰酶可使淀粉中的支链淀粉脱支而形成直链淀粉,从而提高淀粉膜的性能。利用正交实验法,以玉米淀粉基复合膜的抗拉强度为指标,研究得出普鲁兰酶对复合玉米淀粉脱支作用时的最佳工艺条件为:酶用量0.8ASPU/g,pH4.5,时间4h,温度60℃。      

用普鲁兰酶改进玉米淀粉基复合膜性能的研究

以玉米淀粉为原料,选用甘油为增塑剂,羧甲基纤维素钠与海藻酸钠复合为增强剂,采用延流法制备玉米淀粉基复合膜。研究增塑剂的种类、用量,增强剂的种类、用量,烘干温度,延流体积等对复合膜性能的影响。普鲁兰酶可使淀粉中的支链淀粉脱支而形成直链淀粉,从而提高淀粉膜的性能。利用正交实验法,以玉米淀粉基复合膜的抗拉强度为指标,研究得出普鲁兰酶对复合玉米淀粉脱支作用时的最佳工艺条件为:酶用量0.8ASPU/g,pH4.5,时间4h,温度60℃。     

利用酶法测定稻米支链淀粉精细结构

支链淀粉是淀粉粒各级结构形成和稻米理化特性的主要决定因素。本研究对利用酶法测定稻米支链淀粉精细结构的酶解最适反应条件进行了探索和优化,结果表明,测定β-淀粉酶水解率时,对于0.1 g的支链淀粉,β-淀粉酶的最适用量为500 U,反应时间为48 h,反应温度为37℃;测定平均链长时,对于22 mg的支链淀粉,普鲁兰酶的最适用量为4 U,反应时间为24 h,反应温度为37℃;测定A∶B值时,对于1 m L质量浓度为1 mg/m L的β-极限糊精溶液,异淀粉酶的最佳用量为100 U,普鲁兰酶的用量为1 U,二者最适反应时间均为24 h。在条件优化的基础上,利用酶法对8个稻米品种支链淀粉的精细结构进行了测定,8个品种中β-淀粉酶水解率、平均链长、平均外链长、平均内链长、A∶B值的变幅分别为51.22%~62.86%、18.31~20.83、11.38~14.82、4.57~5.93、1.05~1.67。     

响应面法优化普鲁兰酶发酵条件

采用响应面法对一株普鲁兰酶产生菌的产酶条件进行优化。首先,结合单因素实验,通过Plackett-Burmen试验设计,以P0.05为准,筛选出玉米淀粉、玉米浆、初始p H对普鲁兰酶产量有显著影响。根据响应面分析得到普鲁兰酶酶活最佳工艺参数为:玉米淀粉浓度3.49%,玉米浆浓度2.48%,初始p H为6.7。最后,优化后的培养基成分如下:玉米淀粉浓度3.49%,葡萄糖0.4%,玉米浆浓度2.48%,Fe SO40.1%,K2HPO4 0.1%,Mg SO4·7H2O 0.1%,初始p H为6.7,培养温度37℃,初始接种量为6%,酶活达到11.633U/m L。     

来源于Anoxybacillus sp. SK3-4普鲁兰酶PulASK的固定化及酶学性质研究

普鲁兰酶在淀粉加工、多糖制备以及啤酒酿造等领域有着广泛应用。然而,该酶游离下催化产物需分离纯化和本身不可再生限制了其工业应用。磁性纳米材料具有可重复使用、磁回收性质和比表面积大等特点,有助于解决游离酶的工业化应用难题。作者将源于LAnoxybacillus sp. SK3-4的普鲁兰酶PulASK固定在纳米磁性材料Fe₃O₄@Histidine上以制备固定化酶复合体：Fe₃O₄@Histidine/PulASK,测定固定化酶的酶学性质和动力学参数。结果显示,与游离酶PulASK相比,固定化酶Fe₃O₄@Histidine/PulASK的最适反应温度由60 ℃提高到65 ℃,最适pH与游离PulASK相同;在60 ℃,pH 6.0下孵育7 h,固定化酶残余酶活为62%,而游离酶的仅为30%。分析酶动力学数据可知,在60 ℃,pH 6.0的情况下,游离酶PulASK的K_m为4.7 mmol/L,为Fe₃O₄@Histidine/PulASK的1.47倍;Fe₃O₄@Histidine/PulASK的k_cat值是350 s^-1,与PulASK的k_cat值相当,Fe₃O₄@Histidine/PulASK的k_cat/K_m是PulASK的1.57倍;并且Fe₃O₄@Histidine/PulASK在重复使用9次后,活力仍保持50%以上。与PulASK相比,Fe₃O₄@Histidine/PulASK具有良好的热稳定性且可重复使用,具有潜在应用于食品工业的价值。     

一株关中热泉液口普鲁兰酶产生菌的筛选鉴定及部分酶学性质研究

[目的]筛选性能良好的产普鲁兰酶的菌株,对菌株进行多项分类鉴定,初步分离所产生的普鲁兰酶并进行性质研究。[方法]利用糯米粉作唯一碳源分离纯化普鲁兰酶产生菌,通过形态特征观察、生理生化测定、16S r RNA序列分析等实验确定菌株的分类地位。利用硫酸铵沉淀法得到粗酶,分析了酶的最适温度、最适p H、温度和p H稳定性、Na Cl等的耐受性。通过加入普鲁兰多糖诱导物优化培养基,提高普鲁兰酶产量。[结果]从我国陕西地下热泉样品中分离得到的一株普鲁兰酶产生菌WSCF46,经过多项分类鉴定显示其是与Vibrio parahaemolyticus亲缘性最近。菌株WSCF46所产的普鲁兰酶反应最适p H为5.0,最适温度60℃,经诱导培养优化后平均酶活达2.7U/m L。[结论]多项分类结果鉴定菌株为Vibrio parahaemolyticus strain ATCC17802,该菌株产普鲁兰酶相关报道在国内为首次。普鲁兰酶产量较其他来源的酶相比较高,具有进一步研究价值。     

酸性普鲁兰酶基因在地衣芽孢杆菌中的表达

根据Genbank公布的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因突变体序列(AX203843)合成普鲁兰酶成熟肽基因。将该基因插入芽孢杆菌分泌型表达载体pHY-WZX,重组质粒转化地衣芽孢杆菌B60608,重组地衣芽孢杆菌实现普鲁兰酶分泌表达。对重组菌产普鲁兰酶的条件进行优化,以含2%药媒和8%甘油的培养基最适合普鲁兰酶表达。     

应用普鲁兰酶提高黄酒残糟出酒率研究

通过对只加糖化酶工艺、先液化后糖化工艺以及普鲁兰酶加糖化酶糖化三个工艺的研究和试验,综合测定总糖、还原糖、酒精度及残糖等指标,最后得出结论:利用普鲁兰酶加糖化酶糖化工艺可充分利用残糟中的淀粉,提高出酒率,实现清洁和环保生产。