HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化

在对单纯疱疹病毒1型（HSV－1）感染KMB－17细胞后的早期基因反应的研究中,从HSV－1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个1381bp基因一HTRP,基因测序分析表明为与HSV－1感染相关基因（GenBank登录号：AF450482）,含有完整的ORF框架,cds全长924bp,编码308个氨基酸。构建了pGEX-HTRP表达质粒,在大肠杆菌B21加获得了较高的表达,采用Glutathione Sepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白。用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性。     

HSV-2LAT ORF1在Vero细胞中的表达特性及其对细胞活性的影响

目的:研究单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框1(ORF1)的表达特点及其对Vero细胞活性的影响.方法:双酶切和测序验证本实验室构建的HSV-2 LAT ORF1真核表达载体pEGFP-ORF1,并以转染试剂盒Xfect介导其转染至Vero细胞,通过RT-PCR和绿色荧光蛋白检验其在细胞中的表达,用MTT法进行细胞活性分析.结果:重组质粒表达的融合蛋白主要集中细胞核,而空质粒表达的绿色荧光蛋白在细胞核和细胞质中分布均匀;重组质粒对Vero细胞没有损伤作用.结论:HSV-2 LAT ORF1影响了绿色荧光蛋白的分布,可降低空质粒对细胞的损伤作用;其作用位点可能主要定位在细胞核中,为阐明HSV-2 LAT ORF1在潜伏复发中的功能奠定了实验基础.     

神经生长因子家族及其受体研究进展

过去几年在神经营养因子、受体和神经元细胞程序性死亡的研究领域中取得了几项引人注目的进展：（１）神经生长因子（ＮＧＦ）基因家族的其他一些成员包括脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）、神经营养素－３（ＮＴ－３）、神经营养素－４（ＮＴ－４）、神经营养素－５（ＮＴ－５）的发现;（２）神经生长因子三维结构及功能和进化之关系的阐明;（３）定性了两种神经生长因子受体Ｐ７５＾ＮＧＦＲ和原癌基因ｐ１４０＾ｔｒｋＡ以及相关     

HSV-1溶瘤病毒的研究进展

1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virustype1,HSV-1）感染效率高且易于通过基因工程改造,己广泛应用于肿瘤治疗研究和临床实验。溶瘤HSV-1可通过基因工程改造或从HSV-1自发突变株中筛选获得。研究证实溶瘤HSV-1能够有效抑杀肿瘤细胞,可通过多种机制靶向肿瘤细胞,溶瘤HSV-1与放化疗联合使用治疗肿瘤的研究也取得了理想的结果。目前,已有多个溶瘤HSV-1进入临床试验。     

树突状细胞治疗神经胶质瘤

已用于淋巴瘤、黑素瘤、前列腺癌和肾细胞肿瘤的树突状细胞疫苗也可能给恶性脑神经胶质瘤病人提供了最大的希望,Cedars—Sinai医学中心Maxine Dunitz神经外科研究所的科学家能将杀肿瘤T细胞导入脑肿瘤部位,诱导全身性免疫反应。     

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。     

胶质细胞源性神经营养因子受体α1基因的克隆表达及其活性研究

为了获得重组胶质细胞源性神经营养因子受体α1（glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha1, GFRα1）并研究其生物学活性,从新生4天的SD大鼠海马组织中提取总RNA,通过 RT-PCR方法,扩增出GFRα1 cDNA.将GFRα1 cDNA克隆至含T7启动子的质粒pET-28a（+）中,构建表达质粒pET-GFRα1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,获得表达菌株BLGFRα1.表达菌株经1 mmol/L IPTG诱导3～5 h后,GFRα1蛋白表达,并形成包涵体.凝胶自动扫描分析表明,GFRα1表达量占全菌总蛋白的21.5%,用Ni²⁺-NTA树脂纯化和复性后,纯度达90%以上,复性的重组GFRα1蛋白可显著介导GDNF促PC12细胞的存活和分化作用.     

扇贝糖胺聚糖对感染HSV-Ⅰ小鼠免疫功能的影响研究

目的:研究扇贝裙边糖胺聚糖(glycosaminoglycan from Scallop Skirt,SS-GAG)对感染单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type,HSV-Ⅰ)小鼠免疫功能的影响。方法:通过在无菌条件下给予小鼠注射扇贝糖胺聚糖SS-GAG,连续11天,并在给药第三天给小鼠腹腔注射HSV-Ⅰ病毒悬液建立小鼠感染模型,用MTT等方法观察SS-GAG对HSV-Ⅰ感染小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响、对脾脏指数、胸腺指数的影响以及对脾淋巴细胞转化能力等免疫指标的影响。结果:与病毒对照组相比,扇贝糖胺聚糖SS-GAG低剂量组、中剂量组、高剂量组均能显著增强HSV-Ⅰ感染小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬活性和HSV-Ⅰ感染小鼠的脾脏指数和胸腺指数(P0.01),并且能促进其脾淋巴细胞转化增殖能力(P0.01)。结论:扇贝糖胺聚糖在体内有一定的抗Ⅰ型单纯疱疹病毒作用。其抗病毒作用可能与增强机体免疫功能有关。     

HSV-1感染大鼠骨髓间充质干细胞及形成潜伏感染的初步研究

在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察单纯疱疹病毒1型感染骨髓间充质干细胞情况.分离并鉴定BMSCs;HSV-1感染BMSCs,观察细胞病变(CPE);建立BMSCs的HSV-1潜伏感染模型.提取总DNA,PCR法扩增BMSCs内的HSV-1特异性片段,检测HSV-1感染BMSCs及潜伏感染.结果显示骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高、形成钙结节,表现出成骨细胞特性.HSV-1感染BMSCs,出现典型的CPE,PCR法证实BMSCs内存在HSV-1的特异性片段.HSV-1潜伏感染的BMSCs,未出现明显的CPE,细胞传至7代,仍可测到HSV-1的基因片段,表明BMSCs有可能形成HSV-1的潜伏感染.大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞.HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞并有形成潜伏感染的趋势.     

Gangliosides Inhibit Platelet-Derived Growth Factor-Stimulated Receptor Dimerization in Human Glioma U-1242MG and Swiss 3T3 Cells

Abstract: We previously showed that gangliosides inhibit DNA synthesis in Swiss 3T3 cells stimulated with platelet-derived growth factor (PDGF) in a dose-responsive manner. This correlated with the inhibitory effects of several gangliosides (except GM3) on tyrosine phosphorylation of the PDGF receptor (PDGFR). [³⁵S]Methionine-labeled Swiss 3T3 cells were incubated either with or without gangliosides and stimulated with PDGF, and proteins were cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis revealed that two protein bands (170 and 350 kDa) were specifically immunoprecipitated with an anti-PDGFR antibody. Using both Swiss 3T3 and human glioma U-1242MG cells, western blots with anti-PDGFR and anti-phosphotyrosine antibodies confirmed that these bands were the PDGFR monomer and dimer, respectively, and that phosphotyrosine was present in these bands only after cells were stimulated with PDGF. Of the gangliosides tested, GM1, GM2, GD1a, GD1b, GD3, and GT1b, but not GM3, inhibited the formation of the 350-kDa band. These results demonstrate that all gangliosides tested, except GM3, probably inhibit PDGF-mediated growth by preventing dimerization of PDGFR monomers. Loss of more complex gangliosides in human gliomas would permit unregulated activation of the PDGFR, contributing to uncontrolled growth stimulation. We propose that ganglioside inhibition of receptor dimerization is a novel mechanism for regulating and coordinating several trophic factor-mediated cell functions.     

HSV-1UL-12基因的克隆、表达及产物复性

目的:克隆及表达单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)UL12基因,对其表达产物HSV-1碱性核酸酶(AN)进行复性,为建立抗HSV-1药物的分子筛选模型奠定了基础,对于寻找抗病毒药物具有重要意义.方法:从HSV-1感染的Vero细胞中提取HSV-1基因组DNA,通过PCR克隆出UL12基因并对其测序;然后将HSV-1 UL12基因先克隆至pMD19-T载体,再亚克隆到pET32a表达载体上,并将重组载体转化到E.coli Rosetta菌中进行表达;最后用梯度盐酸胍对表达出的包涵体进行复性.结果:成功构建了pET32a-UL12重组载体,经序列比对,与GenBank上公布的HSV-1国际标准毒株17株的UL12基因序列的同源性达到了99.2%.在E.coli Rosetta菌中以包涵体的形式表达,经复性得到有活性的HSV-1碱性核酸酶(AN).AN同时具有核酸外切酶和核酸内切酶的活性,与核酸作用60min时酶活性最高.结论:重组载体pET32a-UL12经表达、复性可获得有活性的HSV-1 AN.     

67kD层粘连蛋白受体的克隆、表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响

探讨细胞膜表面 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7kDlamininreceptor ,6 7LR)在肝癌细胞侵袭转移中的作用 ,从肝癌细胞中提取RNA ,通过RT PCR扩增 6 7LR的前体——— 37kD层粘连蛋白受体前体(37kDlamininreceptorprecursor,37LRP)基因并定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1 myc His(- )A ,采用脂质体将重组质粒转染到HepG2肝癌细胞中 ,通过G4 1 8筛选和RT PCR、流式细胞术鉴定 ,获得了细胞膜表面 6 7LR高表达 (阳性率为 6 9.2 % )和低表达 (阳性率为 1 1 .7% )的细胞克隆 ,采用体外细胞侵袭实验测定不同细胞的侵袭能力 ,发现膜表面 6 7LR高表达的细胞侵袭能力明显高于低表达及不表达细胞 ,说明 6 7LR在肝癌细胞侵袭转移过程中可能具有重要意义     

Inhibitory effects of Ginsenoside Rb1 on apoptosis caused by HSV-1 in Human Glioma Cells

To investigate the inhibitory effects of Ginsenoside Rb1 (GRb1) on apoptosis caused by Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) in Human Glioma Cells (U251),U251 cells were infected by HSV-1 at a multiplicity of...     

第四军医大学唐都医院实验外科

目的：探讨易洛魁家族同源盒基因IRX1（Iroquois homeobox gene）在胶质瘤中的表达及其临床意义。方法：收集4 位胶质瘤 患者的胶质瘤组织和癌旁/ 正常组织各1 例,收集54 例胶质瘤组织（WHO I级5例,II 级16 例,III 级14 例,IV 级19 例）,采用 PCR方法检测IRX1基因在胶质瘤细胞（U87、U373、LN229 和T98G）中的表达,Western Blot 检测4 组同一患者来源的胶质瘤组 织中IRX1 的表达,免疫组织化学法（IHC）检测IRX1 在胶质瘤组织中的表达及临床特征。结果：PCR 结果表明以正常脑组织为对 照,IRX1 基因在多种胶质瘤细胞中均有表达（P＜0.05）;Western Blot 结果显示IRX1 蛋白在胶质瘤组织中的表达显著高于癌旁组 织或正常组织（P＜0.05）;IHC结果显示IRX1蛋白在良性胶质瘤组织中主要定位于胞浆,而在恶性胶质瘤组织中定位于细胞核, 且其表达量与胶质瘤的恶性程度相关,恶性程度越高,其在细胞核中的表达量越高（P＜0.05）。结论：IRX1可能参与调控恶性胶质 瘤的发生发展过程,IRX1 的表达与胶质瘤的恶性程度有关,暗示了IRX1 可作为判断胶质瘤预后以及肿瘤靶向分子治疗的指标。     

神经生长因子低亲和力受体(p75NTR)的模拟配基的筛选

人神经生长因子低亲和力受体 (p75NTR)转染R2细胞而建立的R2L1细胞 ,在去血清培养时发生凋亡 ,该作用可被神经生长因子 (NGF)所抑制 .用R2L1和R2两种细胞差式筛选噬菌体随机 7肽库和 1 2肽库 ,获得和p75NTR特异结合的噬菌体 .测定DNA序列后得到有关多肽的氨基酸序列 .7肽库共有序列为C (H D)LP(K M)HPM C ;1 2肽库优势序列为TLPSPLALLTVH .化学合成相应的 2个短肽 .用细胞结合法和ELISA方法证实阳性噬菌体和合成短肽能与p75NTR结合 ,并证实了它们对R2L1细胞去血清培养后的凋亡有抑制作用     

神经胶质瘤细胞ATF5表达水平对HCMV复制的影响

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在神经胶质瘤细胞中的复制水平不一,其机制尚不清楚。本研究通过下调转录激活因子5(ATF5)在神经胶质瘤细胞中的表达,检测HCMV感染神经胶质瘤细胞后病毒复制水平的变化。首先用HCMV AD169(MOI=5)分别感染U87、SY5Y及A172细胞,观察细胞形态变化,分别在24、48、72、96、120 h取各时间点上清液检测病毒滴度;Real-time PCR检测HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表达情况;Western-blot检测病毒基因编码蛋白及ATF5表达的情况。结果显示HCMV在U87、SY5Y细胞中复制水平与病毒在A172细胞中复制水平相比,U87、SY5Y细胞组明显高于A172细胞组(P0.05),ATF5表达在U87、SY5Y细胞组与A172细胞组相比,U87、SY5Y细胞组ATF5表达明显高于A172组(P0.05);利用慢病毒介导的RNA干扰技术下调ATF5在U87、SY5Y细胞的表达,用HCMV感染细胞检测病毒基因及蛋白的表达,结果ATF5表达下调可抑制HCMV的复制(P0.05)。以上结果表明,在胶质瘤细胞中下调ATF5表达水平可以抑制HCMV的复制水平。     

Expression of the Gm1-Species, [NeuN]-GM1, in a Case of Human Glioma

Altered glycosylation is a common feature in tumors of various kind and particular interest has been focused on the expression of tumor-associated gangliosides. We have previously identified some human glioma-associated gangliosides and in this study yet another, not previously described, ganglioside has been isolated. The ganglioside was prepared from human glioma tissue taken at autopsy. The new ganglioside bound cholera-toxin B-subunit and its structure was confirmed by fast atom bombardment—mass spectrometry to be NeuN-GM1 (II³NeuNH₂-GgOse₄Cer). In the dissected tumor specimen, the concentration of NeuN-GM1 was 0.1 mol/g wet weight and accounted for approximately 20% of the monosialoganglioside fraction. Normal human brain tissue specimens (n = 10) did not contain detectable (>0.5 nmol/g wet weight of tissue) amounts of NeuN-GM1, indicating that this ganglioside might be associated with human glioma. However, none of the 17 other tumour specimens reveal any detectable amounts of this ganglioside. In conclusion, NeuN GM1 is a glioma-associated ganglioside but its exceptional expression limits its relevance as a molecule involved in general tumor biology.     

血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓？…

朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取细胞总ＲＮＡ,采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到ＶＥＧＦ受体Ｆｌｔ－１胞外区前３个ＩｇＧ样区域ｃＤＮＡ片段（Ｆｌｔ－１ｎ３）。将获得的受体基因克隆到真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１中,得到重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌｔ－１ｎ３,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）,用Ｇ４１８筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选