基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素LR单链抗体筛选与鉴定

【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微囊藻毒素LR的检测灵敏度（IC10）为13 ng•mL-1,抑制中浓度（IC50）为435 ng•mL-1,线性范围在31—5 952 ng•mL-1。【结论】本研究筛选到的单链抗体,有潜力应用于微囊藻毒素LR的免疫学检测或免疫亲和柱的制备,同时也探索了一种高效的微囊藻毒素LR单链抗体的库筛选、鉴定方法。     

抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选

 【目的】构建单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。     

抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定

利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。     

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

从抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段,再经重叠延伸PCR拼接扩增得到单链抗体基因(ScFv),克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上。然后转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建成抗DON毒素噬菌体单链抗体库,库容约为1.1×105,滴度为1.3×108pfu。随机选取10个克隆进行双酶切鉴定,结果显示均有ScFv基因片段插入。抗DON毒素单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达抗DON毒素单链抗体奠定了基础。     

IgM型单克隆抗体之scFv库的建立与筛选

从一个抗脂磷酸聚糖IgM型单克隆抗体细胞的mRNA中经RT-PCR克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后将VH、Linker和VL连接成scFv,并克隆到载体pCANTAB-5E,转Escherichia coliTG1感受态细胞,构建了单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗—富集—扩增"3轮以后,得到针对脂磷酸聚糖特异性的噬菌体抗体。测序结果表明,该scFv的VH基因序列全长390 bp,编码127个氨基酸;VL基因序列全长341 bp,编码113个氨基酸。二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基。     

硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库的构建与初步筛选

旨在构建硫代磷酸酯类杀虫剂单链抗体(ScFv)库,并对其进行初步筛选。采用RT-PCR法从牛血清蛋白(BSA)人工抗原免疫的Balb/C小鼠脾细胞中克隆出VH和VL基因,通过重叠延伸PCR方法将VH和VL基因拼接在一起,构建ScFv基因,与表达载体pCANTAB 5E连接后,在大肠杆菌中诱导表达。采用亲和富集法,经6轮淘筛后用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定其活性。得到滴度为2.2×106 pfu/mL噬菌体库,ELISA检测呈阳性。说明成功表达并筛选得到鼠源抗硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库。     

2种不同无色孔雀石绿单克隆抗体的制备

【目的】制备无色孔雀石绿（LMG）单克隆抗体,并分析其生物学特性,为建立LMG残留的免疫学检测方法奠定基础。【方法】通过改进的碳二亚胺法制备无色孔雀石绿牛血清白蛋白偶联物(LMG-BSA)与副品红牛血清白蛋白偶联物（PA-BSA）,用紫外扫描、质谱法方法鉴定偶联物。利用制备的LMG-BSA与PA-BSA作为免疫原,免疫4～5周龄Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备LMG单克隆抗体,并对其效价、亲和力、灵敏度和特异性等进行分析。【结果】LMG-BSA与PA-BSA的偶联比率分别为7∶1和37∶1;经间接酶联免疫吸附（ELISA）法筛选,由LMG-BSA和PA-BSA抗原各获得1株杂交瘤细胞,分别命名为L-1、P-1。这2株细胞株分泌的单克隆抗体纯化后,经测定效价分别为1.25×10⁵和6.25×10⁶,亲和力常数分别为4.92×10⁹和1.44×10⁸ L/mol,半抑制质量浓度（IC₅₀）分别达8.03和10.5 μg/L。L-1分泌的单克隆抗体仅与孔雀石绿存在交叉反应,交叉反应率为100%;P-1分泌的单克隆抗体与孔雀石绿及副品红均存在交叉反应,交叉反应率分别为80%与100%。【结论】成功获得了2株LMG单克隆抗体,其均可用于水产品中LMG残留的快速检测。     

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库的构建与鉴定

通过构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)驼源重链抗体文库,并鉴定抗体文库的多样性,为筛选抗BVDV特异性重链抗体奠定基础。利用灭活的BVDV免疫双峰驼,多次免疫后测定血清抗体滴度,采集免疫后的血液并分离其外周淋巴细胞,抽提RNA,用RT-PCR法扩增重链抗体可变区(VHH)片段;将其克隆至载体pCANTAB5E,电转大肠杆菌TG1获得VHH抗体基因库,检测抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体文库多样性。结果表明,所构建的抗体文库的库容量为4.32×105;测序和聚类分析表明,抗体文库多样性丰富。利用辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库,测定滴度达1.3×1012 cfu/mL。     

抗红斑丹毒丝菌的rSpaA蛋白猪源单链抗体库构建及单链抗体淘选

从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。     

Isolation of Goose-origin scFv Antibodies Against Goose Parvovirus from Bacterial Display Antibody Libraries

Goose parvovirus (GPV) can cause a highly contagious and fatal gosling plague (GP) disease in goslings and muscoy ducklings.Here,three goose-origin neutralizing single chain variable fragment (scFv) antibodies against GPV SYG-61 were isolated.The genes of scFv antibodies were derived from goslings immunized with GPV SYG-61,and scFvs were subcloned into a pBSD vector for the construction of pBSD-scFv libraries.The pBSD-scFv libraries were screened following three rounds using VP2 (protective antigen of GPV) as the bait by flow cytometry (FCM).After screening,the 15 clones with high mean fluorescence intensity (MFI) were isolated and sequenced.These 15 scFvs were expressed by pET-28a (+) in E.coli.The specificity and affinity of the 15 purified scFvs were successfully confirmed by ELISA.In the preliminary neutralization experiment on primary goose embryo fibroblast (GEF) in vitro,three of the 15 purified scFvs (named scFv-10,scFv-11 and scFv-50) showed significant neutralizing capacities.The study generated the first goose-origin neutralizing scFv against GPV and laid the foundation for the appearance of full-length goose-origin neutralizing monoclonal antibody against GPV.     

抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选

为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。     

抗犬细小病毒单链抗体库构建及其亲和力检测

为获得高亲和力抗犬细小病毒单链抗体,构建抗犬细小病毒(CPV)细菌展示单链抗体文库。研究提取犬脾脏总RNA,反转录c DNA,以此为模板,分别扩增犬抗体VH和VL编码序列,插入克隆载体p Tlinker。利用SfiⅠ酶切位点将sc Fv基因构建至细菌展示载体p BSD中,将重组质粒电转化入E.coli DH5α构建p BFD-sc Fv细菌展示库。通过标记FITC的VP2蛋白,利用流式细胞术筛选12株阳性sc Fv。将12株sc Fv基因分别插入p ET-28a,构建重组表达质粒p ET28a-sc Fv。转化到E.coli Rosetta中诱导表达,获得约28 ku目的蛋白。经ELISA检测,纯化sc Fv对VP2蛋白P/N值均大于2.1,其中sc Fv-23、sc Fv-33、sc Fv-34对VP2蛋白亲和力较强。研究通过免疫本动物源动物,在获得高价抗体同时,避免传统单克隆抗体的免疫排斥现象;结合流式细胞术和细菌展示技术可对单链抗体文库高效、快速筛选。抗犬细小病毒同源单链抗体研究在填补市场同源基因工程抗体空白的同时,可为研制具有中和活性全长抗体奠定基础。     

基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。