红鲫Sox1和Sox11b基因保守区的克隆与表达分析

目的 进一步理解鱼类Sox基因的进化和表达方式.方法 采用兼并引物PCR,从红鲫基因组DNA中克隆、测序和分析Sox基因.采用RT-PCR,研究Sox基因在红鲫13种不同组织中的表达.结果 克隆和测序了红鲫Sox1-1、Sox1-2、Sox1-3、Sox11b1-1、Sox11b1-2和Sox11b2基因的HMG盒区序列.Sox1-1、Sox1-2和Sox1-3编码相同的氨基酸,在肝、脾、肾、心脏和脑组织中均有不同程度表达, 在脑组织中检测到大量的转录物.Sox11b1-1和Sox11b1-2编码相同的氨基酸,系统发生树显示,红鲫Sox11b1和Sox11b2基因与斑马鱼Sox11b基因聚在一起,而远离斑马鱼Sox11a基因.在下丘脑和小脑中检测到Sox11b1-1和Sox11b1-2基因转录物,而没有检测到Sox11b2基因转录物.结论 Sox1和Sox11b基因在进化过程中发生了复制.Sox1基因可能在神经系统中起着重要的作用.Sox11b1-1、Sox11b1-2和Sox11b2有相似而不同的表达方式.     

红鲫Sox4基因保守区的克隆与序列分析

目的 为进一步全面理解鱼类Sox基因的复制与进化,从红鲫基因组DNA中克隆Sox基因HMG盒保守区.方法 参照Sox基因HMG盒保守区的氨基酸序列设计一对兼并引物,以红鲫基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行亚克隆和测序.结果 获得2个序列(序列Ⅰ和序列Ⅱ).同源性比较显示,序列Ⅰ和序列Ⅱ编码的氨基酸序列均与小鼠Sox4的同源性最高,分别为88.9%和90.7%;氨基酸序列排序比较,序列Ⅰ和序列Ⅱ也都与人Sox4的同源性最高.结果表明,红鲫序列Ⅰ和序列Ⅱ均是小鼠、人Sox4基因的直向同源基因,分别命名为RcSox4-1和RcSox4-2.结论 Sox4基因在红鲫进化过程中发生了基因复制,Sox4基因复制可能发生在红鲫、斑马鱼及草鱼分化之前.     

红鲫DMRT1基因保守区的克隆与序列分析

目的进一步理解鱼Dmrt1基因的进化。方法利用兼并PCR技术,从红鲫基因组中克隆和测Dmrt1基因保守区的3个序列,分别命名为RcDmrt1a-1、Rc Dmrt1a-2和RcDmrt1b。结果 RcDmrt1a-1与RcDmrt1a-2、RcDmrt1b核苷酸同源性分别为92.2%、83.7%,RcDmrt1a-1与RcDmrt1a-2这2个序列的氨基酸组成完全相同。它们与RcDmrt1b的氨基酸序列有4个碱基不同。结论红鲫Dmrt1基因与斑马鱼、中国鳄、鸡、人的Dmrt1基因相比,显示了红鲫Dmrt1基因在结构上的保守性,暗示了在进化中功能的保守性。     

红鲫Sox基因的聚合酶链反应扩增

目的 克隆雌雄红鲫Sox基因.方法 采用聚合酶链反应以特异扩增人SRY基因HMG-box保守区的一对引物以及扩增雌雄红鲫Sox基因(SRY-box gene).结果 雌雄红鲫个体均扩增出与人SRY基因大小相同的片断,大小约为220 bp.结论 红鲫Sox基因大小约为220 bp,且雌雄个体间无性别特异性.     

人Sox2对CD133基因启动子的调控研究

目的构建人Sox2基因的真核表达载体并研究其对CD133基因启动子的调控。方法采用PCR方法,从人乳腺癌细胞MCF-7的cDNA中扩增出Sox2基因全长,将其定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0中,构建重组质粒pcDNA-Sox2,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,分别将空载pcDNA3.0与重组质粒pcDNA-Sox2转染人神经胶质瘤U251细胞系,通过RT-PCR和Western blot方法,验证Sox2 mRNA和蛋白的表达。同样采用PCR方法,以人全基因组DNA为模板扩增CD133基因的启动子P1-3片段,并将此片段克隆到PGL3-basic荧光素酶报告基因质粒中,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,将空载PGL3-bas-ic与PGL3-CD133-p1-3转染人神经胶质瘤U251细胞系,用双荧光素酶检测方法分析Sox2对CD133基因转录水平上的调控。结果扩增出954bp的Sox2基因,并检测到重组质粒Sox2 mRNA和蛋白的表达。扩增出2440bp的CD133-p1-3启动子片段,且Sox2可上调CD133基因启动子的表达。结论成功构建了人Sox2基因真核表达载体,以及CD133启动子荧光素酶报告质粒,并检测到Sox2与CD133之间存在一定的调控关系,为进一步研究人Sox2对CD133的作用奠定了基础。     

Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

[摘要]：目的 构建斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,经体外转录合成斑马鱼pax5基因的反义mRNA探针。方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。结果 采用RT-PCR和pCS2+载体等相关技术获得了斑马鱼pax5基因克隆,经酶切、菌落PCR以及测序鉴定证明得到了pCS2+-pax5重组质粒以及pax5基因的反义mRNA探针,经过斑马鱼全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况。结论 成功构建了pCS2+-pax5重组质粒、制备了pax5基因的反义mRNA探针以及完成了野生型斑马鱼不同时相的全胚胎原位杂交。     

洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比较

目的克隆红曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH,并进行序列分析和同源性比较。方法根据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因序列设计引物,以土曲霉和红曲霉基因组DNA为模板PCR扩增lovE和mkH基因并克隆到pMD19Tsimple载体。利用DNAMAN等软件以及互联网资源对lovE和mkH测序结果与其编码的氨基酸序列进行分析比对。结果分别扩增得到1 512 bp和1 464 bp的目的片段lovE和mkH。结论lovE和mkH同源性很高,并与GeneBank中相关已知序列基本相同,是洛伐他汀生物合成酶调控基因,且其表达产物为GAL4类转录因子。     

IFITM1克隆测序及生物信息学分析

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因(interferon induced transmembrane protein 1.IFITM1)克隆、测序,对序列进行分析,并获取生物学信息.方法 以IFITM1的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,在EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,将IFITM1的cDNA片段克隆到pUCm-T质粒,对重组的pUCm-T-IFITM1测序后,采用All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences Database 和 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)对IFITM1的cDNA进行生物信息学分析. 结果扩增后,含有IFITM1基因cDNA的PCR产物约1000 bp,IFITM1的 cDNA成功克隆到pUCm-T质粒并进行测序.序列分析结果显示,IFITM1结构cDNA全长683bp, 有2个外显子.IFITM1的 mRNA编码的氨基酸在37～57和87～107有2个跨膜区,编码125个氨基酸的多肽,其蛋白相对分子质量为14kDa.结论 IFITM1基因的成功扩增、克隆、测序,获取了IFITM1基因的cDNA、mRNA以及编码蛋白质氨基酸的生物学信息,有利于研究IFITM1基因与大肠癌的关系.     

冈田绕眼果蝇丝氨酸蛋白酶抑制蛋白基因的克隆及组织表达水平

目的筛选并鉴定冈田绕眼果蝇转录组中的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serine protease inhibitor,serpin)基因,分析其基因结构及在不同发育时期的表达水平。方法利用PCR技术克隆冈田绕眼果蝇serpin基因,对其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用MEGA 7. 0软件对获得的serpin基因进行系统进化树分析;利用HMMTOP version2. 0和TMHMM server version 2. 0软件预测serpin基因的跨膜结构域;利用RT-q PCR检测冈田绕眼果蝇几个不同发育时期(卵、蛆、蛹、雄蝇和雌蝇)中serpin基因表达水平。结果从冈田绕眼果蝇中克隆出serpin基因,开放阅读框全长1 323 bp,编码440个氨基酸,冈田绕眼果蝇serpin基因与其他果蝇serpin基因的氨基酸序列一致性最高为76%,serpin基因序列的系统进化分析表明冈田绕眼果蝇与Drosophila arizonae的进化关系最接近。冈田绕眼果蝇serpin存在跨膜结构,跨膜螺旋区的位置是第21～43位氨基酸。冈田绕眼果蝇serpin基因在卵、蛆、蛹、雄蝇、雌蝇等不同发育阶段中表达量不同,其中卵的表达量最高。结论成功克隆出冈田绕眼果蝇serpin基因序列,其编码蛋白主要在卵、蛆和雄蝇表达量高,为进一步研究冈田绕眼果蝇serpin基因功能奠定了基础。     

转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定

[目的]克隆转录抑制因子Bmi-1基因并构建其正、反义真核表达载体，为研究其功能及其作用机制奠定基础。[方法]根据Bmi-1基因已知序列，设计合成一对引物，上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点，用反转录PCR（RT-PCR）方法从人红白血病细胞株（K562）总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段（1017 bp），插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-Bmi-1载体，经限制性核酸内切酶谱证实后，再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中，构建pLNCX2-Bmi-1真核表达载体，并经测序证实。然后以pLNCX2-Bmi-1为模板，物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171bp长度的核苷酸片段，并反向连接于表达载体（pLNCX2）上。[结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确，RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段，正义DNA片断长度为1029bp，反义片断长度为171bp，Bmi-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中。[结论]Bmi-1正义及反义片断被成功扩增，并成功构建了Bmi-1正、反义重组真核表达载体，为进一步研究该基因打下了基础。     

红鲫实验动物与本地鲫营养成分的比较

目的测定红鲫实验动物、本地鲫的含肉率及肌肉营养成分，为红鲫饲料科学配制提供参考依据。方法选用24尾1龄红鲫幼鱼、21尾1龄本地鲫幼鱼，按常规方法测定，并计算其能量和E／P值（能量蛋白比）。结果红鲫、本地鲫的含肉率为46．34％、55．83％；红鲫、本地鲫肌肉（鲜样）中分别含水分79．11％、81．41％，粗蛋白质12．47％、14、38％，粗脂肪6、95％、1．88％，粗灰分1.01％、1．32％，无氮浸出物0．47％、1．01％，能量5．65kJ/g、4．32kJ／g，E／P值（能量蛋白比）为45．32kJ/g、30．03kJ／g。结论红鲫实验动物与本地鲫含肉率及肌肉营养成分有一定差异。     

用差示PCR法筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中的高表达基因

目的 筛选类风湿性关节炎（RA）滑膜细胞中的高表达基因,以探讨RA滑膜细胞发生肿瘤样增殖和侵蚀软骨的分子机理。方法 以骨性关节炎（osteoarthritis,OA)滑膜细胞作对照,采用差示PCR（differentially display PCR)方法,克隆RA滑膜细胞中高表达的cDNAs片段,经反向点杂交排除假阳性克隆后,将阳性克隆进行基因序列分析,结果共回收76仆差异条带,得到42个有插段的克隆,经反向点杂交后得到22个阳性克隆,对其中19个克隆进行基因序列分析表明,最长片段为501bp长,最短片段为145bp长,大部分在300bp,有13个克隆为已知基因,其中包括组织蛋白酶,其它6个克隆为未知序列,这些未知序列中除一个序列外酶,其它6个克隆为未知序列,这些未知序列中除一个序列外都为基因的非编码区,结论 差示PCR方法在筛选差异表达基因方面存在着很大的局限性,组织蛋白酶B可能与RA滑膜细胞的软骨侵蚀性有关。     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

辐射抗性小鼠与其亲代差异基因的表达序列标签

目的寻找IRM-2小鼠体内存在的与辐射抗性相关的基因。方法提取IRM-2小鼠和其亲代小鼠脾细胞总RNA,利用mRNA差异显示技术挑选差异表达片段,对每一条差异带进行特异PCR扩增、克隆和测序。结果获得IRM-2小鼠独有而亲代小鼠均无的cDNA差异带75条,经测序获得52条差异cDNA序列。与GenBank基因库同源性比较,得到21条与小鼠已知基因不同源的表达序列标签（EST）。结论21条EST提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

抑制差减杂交方法筛选辐射诱导细胞恶性转化模型中的差异表达基因

目的:筛选辐射诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型中的差异表达基因.方法:应用抑制差减杂交方法(SSH)构建辐射诱导的细胞转化模型差异表达基因的cDNA文库.对差减文库进行PCR筛选,对得到的差异片段进行测序及BLAST分析;对部分筛选出来的差异表达基因使用荧光定量PCR方法检测并确认其变化;将新的序列表达标签(EST)登录到GenBank上.结果:在80个进行测序的克隆中,得到确定序列的共73个.在转化细胞中表达下降的序列41条,BLAST比较分析结果:得到已知序列6条;未知基因的EST序列20条;空载体序列7条;8条为重复测定序列.在转化细胞中表达上升的序列32条,BLAST分析:已知序列14条;未知基因的EST序列9条;重复测定的序列9条.对其中的部分基因改变进行荧光定量PCR检测,结果表明辐射转化组中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表达量明显增加(与对照组相比,转化组中的mRNA分别增加了3.49、29.38、12.99、5.00倍);而PCBP2、RPL15、TCERG1的表达量下降(与对照组相比,转化组中的mRNA分别减少了1.89、48.77、11.95倍).将得到的29个未知序列登录到GenBank,序列ID:EB643220～EB643248.结论:利用抑制差减杂交方法成功建立了恶性转化细胞模型差异表达cDNA文库,包含大量功能未知的新基因;ZNF143表达增加,其与细胞的增殖与分裂有关,TCERG1作为转录辅助激活因子在mRNA转录和后期的修饰过程中起到重要的作用,PCBP2是一个Polyc连接蛋白,具有蛋白翻译调节功能,这些基因在辐射致癌中尚无研究报道.     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及克隆

目的：构建弓形棒状体蛋白2（ROP2)基因重组质粒。方法：根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，经酶切及PCR鉴定，而后进行测序。结果：ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因，为下一步弓形虫诊断及疫苗研究打下了基础。     

mRNA差异显示筛选卵巢癌相关基因

目的 :利用mRNA差异显示技术研究正常卵巢上皮和卵巢上皮癌之间的基因表达差异状况 ,筛选和克隆卵巢上皮癌相关基因。方法 :通过DD PCR分析正常卵巢上皮和卵巢上皮癌总RNA将差异片段分离并显示出来 ,将其回收 ,利用基因克隆技术将其筛选和克隆出来作为探针进行斑点杂交鉴定、DNA序列测定、通过国际互联网络检索GenBank进行同源性分析。结果 :共筛选克隆鉴定 6个差异显示片段。其中 4个为未知基因片段 ,已收录入GenBank ,GenBank登录号为AF136 413～AF136 417。两个为已知基因片段 ,其中一个克隆 3AOSKN3与GenBank中染色体 17hCIT克隆 98%同源。另外一个克隆 3AON2 8与GenBank中人类NADH :辅酶Q氧化还原酶有 99%的同源性 ,研究表明该基因与肿瘤相关。结论 :上述结果证明mRNA差异显示方法和杂交分析结合已成为一种敏感、高效、快速的差异表达基因的克隆技术