Cx43基因剔除小鼠心脏锥干部的异常发育

目的探讨Cx43基因缺陷小鼠心脏锥干部发育异常。方法选用胚胎（embryonic day,E）11．5d至出生后1dC57／BL6小鼠作为研究对象,根据基因型分为Cx43基因剔除纯合子（Cx43-／-）、杂合子（Cx43＋／-）及野生型（Cx43＋／＋）,采用聚合酶链反应方法鉴定基因型。免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA、平滑肌肌动蛋白α-SMA、神经嵴细胞的标志物AP-2α的表达;原位杂交方法检测AP-2α mRNA的表达。结果Cx43-/-出生后24h内即死亡。大体解剖见明显的右室流出道圆锥部异常膨隆。HE染色示右心室流出道壁大量异常小梁状组织增生突起,右室流出道腔明显狭窄。Cx43＋／-无明显异常。Cx43-／-近端流出道隔中央区域α-SCA的表达明显滞后。Cx43＋／-与Cx43-／-小鼠右室流出道与Cx43＋／＋比较可见比较强的α-SMA的表达,主要位于右侧锥干部的异常增生部位。Cx43-/-小鼠在E13．5流出道隔AP-2α蛋白及其mRNA水平表达均增多,且表达位置异常。结论Cx43 KO小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要特征。Cx43 KO小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞。Cx43 KO小鼠锥干部α-SMA的表达不能正常消退,心肌细胞发育不成熟。神经嵴细胞的发育异常可能参与了Cx43基因缺陷小鼠锥干部畸形的发病机制。     

CMV43CT转基因小鼠心血管发育的形态学研究

目的研究CMV43CT转基因小鼠心血管发育,探讨其用作先天性心脏畸形动物模型的可能性.方法 选用胚胎期(ED)12.5～17. 5 d的CMV43CT胎鼠,经HE染色,观察心脏的形态学变化.对生后不久死亡的CMV43CT纯合转基因小鼠在显微镜下进行大体解剖,观察心脏外形的变化并切片行HE染色.通过FCR方法鉴定基因型,普通C57BL6/SJ小鼠作为对照组.结果所有对照组胎鼠和CMV43CT杂合胎鼠均未见心脏畸形.见62只纯合胎鼠中有14只心脏畸形,占22.6%,主要为圆锥干发育畸形和室间隔缺损.其他畸形包括:心管环化异常及心室肌发育不良.12只生后不久死亡的CMV43CT纯合转基因小鼠大体解剖后发现均有室间隔裂和流出道囊等心脏畸形.切片染色发现左、右室流出道梗阻、房间隔缺损、室间隔缺损、心肌异常肥厚及心肌发育不良等畸形.结论 CMV43CT转基因小鼠存在以圆锥干发育异常为主的心血管畸形,可作为研究先天性心脏病的动物模型.     

连接蛋白40、45在连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达

目的 检测连接蛋白(Cx)40、45在Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达.方法 选取Cx43基因敲除胎鼠,通过PCR方法鉴定其基因型,以Cx43基因敲除胎鼠纯合子作为研究对象,野生型为对照组,获取胎龄10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5 d纯合子及野生型各2只胎鼠,免疫组化检测Cx40、Cx45在心脏各部位的表达,SCIM显微图像分析系统对染色强度进行定量分析.结果 (1)野生型小鼠心室原始小梁网在胎龄10.5 d就已经有Cx40表达(A值为8.6),随后在心房、心室、小梁网、房室间隔和主、肺动脉壁表达逐日增加,胎龄14.5 d在心室部位达到高峰(A值为94.8),然后逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx40在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为7.9,胎龄14.5 d心室部位为75.8.纯合基因敲除型胎鼠Cx40的表达量明显弱于野生型.(2)野生型小鼠肌小梁部在胎龄10.5 d出现Cx45的表达(A值为20.0),随后在房室各部位相继表达,胎龄12.5 d在心房部位达到高峰(A值为49.6),然后表达逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx45在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为17.8,胎龄12.5 d心房部位为31.5.纯合基因敲除型胎鼠Cx45的表达量明显弱于野生型.结论 Cx40和Cx45在Cx43基因敲除小鼠纯合子胎龄10.5～15.5 d这一心脏分隔、瓣膜发育的关键时期表达异常,可能与Cx43基因敲除小鼠心脏的异常发育有关.     

Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的关键基因

 目的 研究Cx43基因纯合敲除（Cx43-/-）小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的关键基因。方法 以胎龄（embryonic day,ED）14.5的Cx43-/-和野生型（Cx43+/+）鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象,分别提取总RNA,逆转录成cDNA,并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化,再与Affymetrix-430 2.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。结果 与Cx43+/+组相比,Cx43-/-组中表达上调2倍以上的基因共有143个,表达下调2倍以上的基因有235个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期、细胞黏附、细胞活动和细胞骨架的信号通路等主要生理过程。进一步筛查表达差异1.5倍以上的基因发现,与圆锥动脉干畸形相关的TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因在Cx43-/-组有明显变化。对这些基因进行荧光定量PCR验证,结果与基因芯片一致（P<0.05）。结论 利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43-/-鼠胚心脏近端流出道发育有关的多个基因,并经荧光定量PCR验证。其中TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因可能与Cx43-/-小鼠流出道梗阻的发生有关。     

Bmpr2在Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的表达

目的 探讨心脏近端流出道隔心肌化的分子机制及其对胎鼠心脏圆锥动脉干畸形(CTD)的影响.方法 以胎龄11.5～16.5 d的连接蛋白43(Cx43)基因敲除(Cx43KO)纯合型(Cx43-/-)、杂合型(Cx43+/-)和野生型(Cx43+/+)胎鼠胚胎作为研究对象,采用PCR方法鉴定其基因型,免疫组织化学法测定骨形成蛋白Ⅱ型受体(Bmpr2)和α横纹肌肌动蛋白(α-SCA)的表达.结果 Cx43KO鼠胚心脏近端流出道隔心肌化细胞明显减少,尤其以胎龄13.5和14.5 d的Cx43-/-为著.胎龄11.5～13.5 d,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜均有Bmpr2表达,心室肌也有微弱的表达;Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏仅心房和心外膜区有Bmpr2的微弱表达.胎龄14.5～16.5 d,Cx43+/+胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmpr2表达,流出道隔未心肌化区域Bmpr2未见表达,与α-SCA表达一致;胎龄14.5 d的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁均有Bmpr2表达,而心室肌、流出道膈未见Bmpr2表达;胎龄15.5与16.5 d的Cx43+/-和Cx43-/-胎鼠心脏的心房、心外膜、心内膜、小梁、心室肌及流出道隔已心肌化区域均有Bmpr2表达,而且Bmpr2在流出道膈未心肌化区域部分表达.结论 Cx43KO胎鼠心脏近端流出道隔存在明显心肌化延迟.Bmpr2很可能涉及心外膜和心肌细胞相互作用的分子机制,参与心肌细胞的成熟过程.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of myocardialization of proximal outflow tract septum and its effect on the conotruncal anomaly in mice. Methods The C57/BL6 mice of embryonic day (E) 1 1. 5 - 16. 5 were selected. The phenotypes of connexin 43 ( Cx43 ) homozygotes ( Cx43 -/- ),heterozygotes (Cx43+/-) and wild-types (Cx43+/+) were genetically typed by polymerase chain reaction (PCR). Bone morphogenetic protein receptor 2 (Bmpr2) and α-sarcomeric acti (α-SCA) were detected by immunohistochemistry. Results The expression of α-SCA in the proximal outflow tract (OFT) septum was delayed obviously in Cx43 -/- predominantly at E13.5 and E14. 5. From E11. 5 to E13. 5, the expression of Bmpr2 was detected in cardiac atrium and epicardium of Cx43+/+ fetal heart. And Bmpr2 was slightly expressed in ventricular muscle of Cx43 +/+ fetal heart. And it was expressed slightly only in cardiac atrium and epicardium of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart. From E14. 5 to E16. 5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium, endocardium, trabeculum, ventricular muscle and OFT septum of Cx43 +/+ fetal heart. At E14. 5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium,endocardium and trabeculum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart while none in ventricular muscle and OFT septum. At E15.5 and E16.5, its expression was detected obviously in cardiac atrium, epicardium,endocardium, trabeculum, ventricular muscle and OFT septum of Cx43 +/- and Cx43-/- fetal heart. Its expression was also detected obviously in OFT septum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart with incompleted myocardialization. Conclusion Cx43KO embryonic mice exhibit delayed myocardialization. As compared with the Cx43 +/+, the expression of Bmpr2 in proximal OFT septum was delayed obviously in Cx43 +/- and Cx43 -/- mice. And the expression of Bmpr2 is abnormal in OFT septum of Cx43 +/- and Cx43 -/- fetal heart. Bmpr2 may be involved in the interaction between epicardium and myocardium. It may be a critical mechanism in the maturation process of cardiac muscles.     

Cx43基因异常胎鼠心脏畸形的超声心动图研究

目的 观察Cx43基因异常引起心功能障碍的超声心动图表现。方法 对胎龄为14．5d、15．5d或16．5d的Cx43基因剔除、CMV43和FZ转基因小鼠胚胎，进行多普勒超声心动图检测、心脏形态学检查和基因型测定。结果 cx43基因异常小鼠胚胎主要表现为心室收缩期射血峰值增高(IPSV)或／和舒张期房室瓣口血流频谱呈单峰(MIP)。IPSV增高与肺动脉口狭窄相一致；而舒张期MIP则与右心室肥厚或右心室扩大相符合。结论 超声心动图在小鼠心脏病模型的研究方面具有较高的价值；Cx43异常可导致肺动脉口狭窄和右室舒张功能障碍。     

连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道组织中转录因子的表达及意义

目的 研究连接蛋白43（Cx43）基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道组织中转录因子的改变,从分子水平探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道发育异常的原因。方法 以胎龄13．5d和14．5d的Cx43基因敲除、Cx43杂合子和Cx43野生型鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象。分别提取总RNA,反转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix 4302．0小鼠全基因组芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。用实时定量逆转录（RT）PCR的方法对基因芯片筛选出的与心脏发育相关的部分转录因子进行验证。结果 与Cx43野生型组相比,Cx43基因敲除组表达差异的基因中,有6个是与心脏发育相关的转录因子。实时定量RT—PCR验证了其中3个基因：Soxll、Foxpl和Tbx20。在胎龄13．5d,Cx43基因敲除鼠胚Sox11、Foxp1的表达量均明显低于Cx43野生型组（4．76±0．19 vs 5．34±0．25,5．08±0．28 vs 5．64±0．15,均P〈0．01）;Tbx20在各组间差异不明显。胎龄14．5d,各基因Sox11、Foxp1以及Tbx20的表达量在基因敲除组均明显低于Cx43野生型组（4．71±0．27 vs 5．00±0．19,5．25±0．31 vs 5．77±0．16,7．05±0．17 vs 7．43±0．25,均P〈0．05）。其变化趋势与基因芯片结果基本一致。结论 心脏特异性的转录因子Foxp1、Sox11和Tbx20等的表达异常可能与Cx43基因敲除小鼠流出道的异常发育有关。     

应用PCR测定Cx43转基因小鼠的基因型

目的：应用聚合酶链反应(PCR)技术，检测Cx43(connexin 43)转基因小鼠的基因型。方法：采用CMV43转基因小鼠和Cx43剔除小鼠分别与野生型小鼠杂交繁殖，切取子代小鼠尾巴制备DNA，应用PCR技术扩增DNA，观察目的基因的阳性率。结果：CMV43转基因小鼠子代66个，dhfr PCR检测阳性率为31．8％。Cx43基因剔除小鼠子代21个，分别与Cx43野生型引物和Cx43剔除引物进行PCR，两者均阳性( ／ )12个，百分率为57．1％，前者阳性而后者阴性(杂合子 ／-)7个，百分率为33．3％，两者均阴性(纯合子-／-)2个，百分率为9．6％。野生型小鼠经Cx43野生型引物PCR检测结果均为阳性。结论：PCR技术用于Cx43转基因小鼠基因型的检测敏感度高，特异性强，易操作，可用作Cx43转基因小鼠心血管畸形模型研究的初选方法。     

小鼠叉头框C2基因变异致室间隔缺损

目的:探讨叉头框C2基因在心血管发生和发育中的作用。方法：通过敲除小鼠叉头框C2基因,解析敲除叉头框C2基因小鼠的心脏发育情况。结果：在98只新生鼠中仅有15只纯合子型叉头框C2基因突变鼠;这些纯合子型动物心脏的室间隔有细小的缝隙连通左右心室;原位杂交显示在10.5 d的胚胎心室内膜有Fox C2 mRNA的表达。结论：敲除叉头框C2基因可使小鼠室间隔发育缺损。     

Downregulation of Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 in the process of delayed myocardialization of cardiac proximal outflow tract septum in connexin 43 knockout mice embryo

Background  The connexin43 knockout (Cx43 KO) mouse dies at birth with an enlarged conotruncal region, which leads to the obstruction of the right outflow tract (OFT). Since myocardialization of the proximal OFT septum is one of the key events during heart development, we investigated the process in the Cx43 KO embryo hearts. Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 (ROCK1), is a recently found key molecule to regulate the myocardialization of OFT, but its spatiotemporal expression pattern during myocardialization remains unknown. The objective of this study was to investigate the differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wild type embryo hearts, and its relationship with the delayed myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

Methods  Using immunohistochemistry, the processes of myocardiolization were investigated both in Cx43 KO and wild type embryo hearts. The differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wildtype embryo hearts was evaluated both at the mRNA and protein level by real-time RT-PCR and immunohistochemistry.

Results  The expression of α-sarcomeric actin (α-SCA) in the proximal OFT septum of Cx43 KO embryos was delayed. Meanwhile, it was shown that the downregulation of ROCK1 coincided with delayed myocardialization. The expression of ROCK1 protein was mainly limited to the proximal outflow tract septum from embryo day (E) E11.5 to E15.5. Its expression pattern was similar with that of α-SCA. Real-time RT-PCR found that the expression level of Rock-1 mRNA began at a low level on E11.5 and reached peak at E13.5 and E14.5.

Conclusions  ROCK1 may have an important role in the process of myocardialization of the proximal OFT septum. Downregulation of ROCK1 is likely to contribute to the aberrant myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

     

人心脏间隙连接蛋白43的时空表达

目的探讨人心脏间隙连接蛋白43(Cx43)的时空表达规律。方法应用SP免疫组化和图像分析方法,检测胎儿、新生儿和成人心肌Cx43蛋白表达和含量变化。结果(1)胎儿和新生儿Cx43呈斑点状遍布于整个心肌的细胞质内和细胞膜表面,少数位于闰盘处;(2)成人Cx43在心房肌细胞非均质分布于细胞侧面连接处和端闰盘处;心室肌典型地排列在闰盘处;(3)Cx43分布密度随年龄增长而降低,且具有腔室差异,胎儿和新生儿心房<心室,成人心房>心室。结论随着年龄的增长Cx43从细胞侧表面向端-端闰盘处转移。这种位置移动是心脏机械收缩和电传导的生理性调整。     

Connexin 43 remodeling induced by LMNA gene mutation Glu82Lys in familial dilated cardiomyopathy with atrial ventricular block

Background Mutations in the lamin A/C gene （LMNA） may cause familial dilated cardiomyopathy （dilated cardiomyopathy） characterized by early onset atrio-ventricular block （A-V block） before the manifestation of dilated cardiomyopathy and high risk of sudden death due to ventricular arrhythmia, which is very similar to the phenotype of gap junction related heart disease. This study aimed to determine the expression and localization of connexins in neonatal myocytes transfected with wild-type （WT） or mutant LMNA to elucidate how these mutations cause heart diseases. Methods We studied the connexin 43 （Cx43） and connexin 40 （Cx40） expression in cultured neonatal myocytes transfected with wild-type （WT） or mutant LMNA （Glu82Lys （E82K） and Arg644Cys （R644C）） using confocal imaging and Western blotting analysis. Results Cx43 protein expression was reduced by 40% in cells transfected with LMNA E82K than that in cells transfected with WT LMNA cDNA. Confocal imaging showed that the Cx43 located inside the cells by LMNA E82K. By contrast, LMNA E82K mutation had no effect on expression and localization of Cx40. LMNA R644C transfection did not show any significant effects on gap junctions at all. Conclusions Our findings suggest that LMNA E82K significantly reduced the Cx43 expression and altered its localization which may be one of the pathological mechanisms underlying LMNA-related heart disease.     

高血压性心脏病猝死者心肌连接蛋白43的表达

目的:探讨高血压性心脏病(HHD)猝死者心肌连接蛋白43(Cx43)表达及其与猝死的关系。方法:挑选我校基础医学院法医学教研室2009-2011年尸体解剖案例20例,分为两组,每组各10例。①HHD组:男性9例,女性1例;年龄为41-73岁,平均年龄56.5岁;均为高血压性心脏病猝死。②非心源性死亡对照组:男性7例,女性3例;年龄为40-53岁,平均年龄46.8岁。每例心脏进行常规病理学检查并取材后,运用免疫组织化学和图像分析技术,检测左心室肌的Cx43染色情况。结果:HHD组心肌Cx43阳性颗粒数量显著减少,着色明显减弱,部分呈颗粒状,且分布于心室肌细胞内或细胞侧-侧连接处;对照组的染色未见明显变化。定量检测并经统计分析发现,HHD组Cx43蛋白染色阳性的面积和平均光密度与对照组均有非常显著的差异(P<0.01)。结论:高血压性心脏病猝死者心室肌Cx43蛋白的表达明显减少,高血压性心脏病的猝死可能与Cx43的表达变化有一定的关系。     

扩张型心肌病患者心肌Cx43基因的表达

目的探讨晚期扩张型心肌病(DCM)患者心肌连接蛋白43(Cx43)基因表达水平及其意义。方法 DCM病例及标本是2002～2003年华中科技大学同济医学院附属同济医院对4例晚期DCM患者进行心脏移植手术切除心脏的心肌;其中男2例、女2例,年龄分别为14、44、45和55岁。对照组4例为同期颅脑损伤和毒品中毒致死者,均为男性,年龄分别为24、29、30和37岁;死因为颅脑损伤3例、毒品中毒1例。每例心脏进行常规病理学检查并取材后,应用逆转录PCR技术定量检测左心室心肌Cx43基因表达水平,并进行比较分析。结果 DCM患者心肌Cx43基因定量检测结果为(0.188±0.167),对照组为(0.440±0.096),两组比较差异有统计学意义(P=0.025)。结论晚期DCM患者心肌Cx43基因表达水平下降,这种心肌Cx43基因表达水平下降可能与DCM患者发生心衰、心律失常和猝死有关。